小型化抗体遺伝子導入による2次代謝活性成分の生合成制御に関する研究

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09877418
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 正山 征洋 九州大学, 薬学部, 教授 (70037604)
• 研究分担者: 田中 宏幸 九州大学, 薬学部, 助手 (30253470) ; 森元 聡 九州大学, 薬学部, 助教授 (60191045)
• キーワード: MAb / scFv / 生合成制御 / フォルスコリン / 阿片アルカロイド / 大麻成分 / ステロイダルアルカロイド配糖体

研究概要

薬用植物を大きく分類すると、活性成分を純粋に単離して医薬品とするものと漢方薬等の抽出エキスとして使用する群に分けられる。申請者は後者について植物細胞組織培養テクニックを駆使して生薬の基原植物の育種研究を行い、均質な品種やパソーゲンフリー品種の育成を行ってきた。本研究では前者に関する研究として、活性成分リッチな品種の育成を目指し、活性成分に対するモノクローナル抗体遺伝子を植物に導入し2次代謝をコントロールするものである。
各種活性成分リッチな品種の選抜アッセイ法として阿片アルカロイド、forskolin、大麻成分、また、ステロイドホルモンの原料となる、solamargine、甘草のglycyrrhizin、人参のginsenoside、柴胡のsaikosaponin等に対するモノクローナル抗体(MAb)を作成し、ELISAによる超高感度定量法を確立している。さらにMAb遺伝子を小型化したシングルチェインFv(scFv)の作成を行っている。この内forskolinとsolamargineに対するMAb産生ハイブリドーマからscFvの作製を行ってきた。
抗forskolin.MAb産生ハイブリドーマから全RNAを抽出しcDNAを合成後、VH、VLに特異的なプライマーを用いてPCRを行い、得られたVHとVLをリンカーで結合しscFvを作製する。さらにベクターpCANTAB5Eを用いて大腸菌に形質転換しクローニングを行った。現在scFvタンパクの大量発現系を確立しAgrotacteriumへの組み換えforskolinを生産するcoleusforskohliiへの形質転換を行っている。なお、抗solamargineMAbscFvの全シークエンシングが終了し、その他のMAbについても同様にスタートしている段階である。

研究成果

• [文献書誌] Y.Shoyama et al: "Genetic and alkaloid analysis of Papover species and their Fl hybrid by RAPD.HPLC and ELISA" Forensic Science International. 91. 207-217 (1998)
• [文献書誌] H.Tanaka et al: "Formation of monoclonal antibody against a major ginseng Component,ginsenoside Rb1 and its characterization" Towards Natural Medicine Research in the 21 st century. 249-259 (1998)
• [文献書誌] H.Tanaka et al: "Formation of a Monoclonal Antibody against Glycyrrhizin and Development of an ELISA" Biol.Pharm.Bull.21(12). 1391-1393 (1998)
• [文献書誌] H.Tanaka et al: "Development of ELISA-analysis methods for the quantitication of bioactive natural products in plants,phytomeclicines and in humans or similar" Phytomedicine. 5(5). 397-415 (1998)
• [文献書誌] H.Tanaka et al: "A simple cletermination of steroidal alkalaid glcosides by thin-layer chramatography immunostaining using monoclonal antibody against solamargine" FEBS Letters. 404. 279-282 (1997)
• [文献書誌] Y.Shoyama et al: "Formation of monoclonal antibody against naturally occurring biologically active compounds and their application" Current Topics in Phytochemistry. 1(1). 43-66 (1997)