部位特異的化学修飾による膜蛋白質高次構造の決定

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09878153
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 山口 明人 大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (60114336)
• キーワード: 立体構造モデル / テトラサイクリン排出蛋白 / 膜蛋白高次構造 / 部位特異的化学修飾 / 異物排出蛋白 / テトラサイクリン / Cys走査変異体

研究概要

本研究では、テトラサイクリン排出蛋白Tet(B)を素材として、蛋白工学的手法により立体構造の推定を行った。まず、Cys-free変異体をもとに、任意の位置の残基をCysに置換した変異体を多数構築し、膜透過性のSH試薬NEMと、膜不透過性のAMSを用いて、生菌体で両者ともに結合するものは菌体表層(ペリプラズム側)、NEMのみ結合するものは菌体の内側という基準で、膜を12回貫通する蛋白であることを、初めて活性のある膜蛋白を用いて実験的に決定することに成功した。この方法は異物排出蛋白のみならず、膜貫通蛋白の構造決定に広く応用できる普遍的な方法である。ついで、連続的にCys置換した一連のCys走査変異体を用いて、疎水的な領域ではNEMとの反応生が悪く、親水的な領域では良いという原理に基づいて、膜貫通領域の範囲を精密に決定した。さらに、これまで立体構造が決定された膜タンパク質の、膜貫通セグメントの配置に法則性のあることを見いだし、その法則に基づいてTetA(B)の膜貫通セグメントを配置し、量子力学的エネルギー計算によって構造を最適化するという手法により、膜輸送蛋白としては初めて、立体構造モデルを構築することに成功した。

研究成果

• [文献書誌] Kimura,T.et al.: "Remote Conformational Effects of the Gly62→Leu Mutation of the Tn10-Encoded Metal-Tetarcycline/H^+ Antiporter of Escherichia coli and Its Second-Site Suppressor Mutation." Biochemistry. 36. 6941-6946 (1997)
• [文献書誌] Hirata,T.et al.: "A Novel Compound,1,1-Dimethyl-5-(1-hydroxypropyl)-4,6,7-trimethylindan,is an Effective Inhibitor of the tet(K)Gene-Encoded Metal-Tetracycline/H^+ Antiporter of Staphylococcus aureus." FEBS Lett.412. 337-340 (1997)
• [文献書誌] Fujihira,E.et al.: "Roles of Acidic Residues in the Hydrophilic Loop Regions of Metal-Tetracycline/H^+ Antiporter of Staphylococcus aureus." FEBS Lett.419. 211-214 (1997)
• [文献書誌] Someya,Y.et al.: "Second-Site Suppressor Mutations for Arg70 Substitution Mutants of the Tn10-Encoded Metal-Tetracycline/H^+ Antiporter of Escherichia coli." Biochim.Biophys.Acta. 1322. 230-236 (1997)
• [文献書誌] Kimura,T.et al.: "Cysteine-Scanning Mutagenesis around Transmembrane Segment III of Tn10-Encoded Metal-Tetracycline/H^+ Antiporter." J.Biol.Chem.273. 1-5 (1998)
• [文献書誌] Kimura,T.et al.: "Roles of Conserved Arginine Residues in the Metal-Tetracycline/H^+ Antiporter of Escherichia coli." Biochemistry. 37(in press). (1998)