凍結胚による効率的遺伝子操作マウスの開発システムの確立

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09878202
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 中尾 和貴 東京大学, 医科学研究所, 寄付研究部門教員 (20217657)
• 研究分担者: 中潟 直己 熊本大学, 動物資源開発研究センター・資源開発分野, 教授 (30159058)
• キーワード: ガラス化凍結保存 / ES細胞 / 標的遺伝子組換えマウス / 胚盤胞 / キメラマウス

研究概要

標的遺伝子組換えマウスを得るには、目的の相同組換え体ES細胞と胚とからキメラマウスを作成する必要がある。キメラマウスを作る手段の一つとして、胚盤胞にES細胞を注入する方法がある。この注入キメラ法は、ES細胞、胚盤胞、受容雌を準備する必要があるが、これらを計画にそって確実に準備することはきわめてむずかしい。多くの場合、準備された受容雌の数が胚盤胞の数に比べて多かったり、逆に少なかったりするなどの無駄が生じる。そこで本研究においては、凍結胚盤胞を使用し、受容雌の数に応じてこれを融解することにより、キメラマウス作成過程の省力化と安定化を試みた。
自然交配より得られた胚盤胞を、我々が開発したガラス化凍結保存法を用いて、液体窒素タンクに保存した。凍結胚盤胞を計画に従って融解し、それにES細胞を注入し、キメラマウスを作成した。キメラマウスは、成熟後交配させ、ES細胞由来遺伝子の子孫への伝達の有無を確認した。
ガラス化凍結胚盤胞80個の融解後の生存成績は、80%(64/80)であった。正常な胚すべてにそれぞれES細胞を注入し、偽妊娠雌マウスに移植したところ2匹の雄キメラマウスが得られた。このキメラマウスの両方からES細胞由来の産仔が得られた。また同様に、それぞれ別々の標的遺伝子組換え体ES細胞6種類から、ガラス化凍結胚盤胞を用いた標的遺伝子組換えマウスの作成を試みた。その結果、融解後得られた正常な胚盤胞のそれぞれにES細胞を注入した結果、ES細胞を注入した胚盤胞の約1〜5%がキメラマウスに発生し、これらのマウスからES細胞由来の遺伝子が伝達された産仔が得られた。このことから、凍結胚盤胞から、標的遺伝子組換えマウスを作成することができることが実証され、統御することがむずかしいマウスの生理によって無駄の多かったキメラマウス作成の効率が格段に向上した。

研究成果

• [文献書誌] Sugihara,K.,et al.: "Rac1 is required for the fomation of three germ layers during gastrulation." Oncogene. 17. 3427-3433 (1998)
• [文献書誌] Nakao,K.,et al.: "Production of chimeric mice from cryopreserved blastocysts." J.Exp Anim. 47. 167-171 (1998)
• [文献書誌] Honda,H.,et al.: "Cardiovascular anomaly,impaired actin bundling and resistance to Src-induced transformation in mice lacking p130^<Cas>." Nature Genetics. 19. 361-365 (1998)
• [文献書誌] Yoshikawa,H.,et al.: "Mice lacking smooth muscle calponin display increased bone formation that is associated with enhancement of bone morphogenetic protein responses." Genes to Cells. 3. 685-695 (1998)