| 研究概要 |
昆虫の匂い分子結合タンパク質(Odorant-binding protein : OBP,は化学感覚毛に存在し、疎水性化合物に結合してそれらを可溶化する働きがあると考えられている。本研究ではキイロショウジョウバエのOBP(OBP57dおよびOBP57e)に注目しており、本年度はこれらの結合する化合物の探索を結合実験によって探索することを目標とした。まず、結合実験に必要となる組み換えタンパク質を得るため、大腸菌発現システムによる合成を試みた。最初に、ペリプラズム発現用のベクターを用いてOBPの合成を行った。ペリプラズム発現は、目的のタンパク質をすでに折りたたまれた状態で回収できる点で優れており、他の昆虫のOBP合成にも用いられている。しかし、OBP57dおよびOBP57eは菌体内で合成は誘導されるものの、ペリプラズム分画へ送られず、可溶化のOBPを回収することができなかった。さらにOBPのペリプラズム発現を専門にやっている研究室(アメリカ・カルフォルニア大学)の協力も得て、さまざまな培養条件を検討したが改善がみられなかった。そこで発現ベクターを改変し、封入体から組み換えタンパク質を回収する方法に変更した。これまでに変性剤の組成や濃度、最適pH、再生バッファーの組成などの条件を検討し、OBPが可溶化する条件をつきとめた。また、陰イオン交換クロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーによる精製の条件設定を行った。封入体からのタンパク質回収で最も問題となるのが、立体構造の評価である。OBPは保存された6つのシステイン残基が特定のペアで3つのジスルフィド結合を形成することが知られている。現在、この問題を解決するため、再生して得られたOBPが正しく折りたたまれているかを評価している段階である。
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