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C型肝炎ウイルス(HCV)粒子形成および成熟化機構の解明を目的として、以下の実験を行った。
1.HCV粒子形成時のウイルスゲノムRNAに対する管理機構について、ゲノムRNAが粒子内に取り込まれる際のリード配列、即ちパッケージングシグナルの探索という観点から検証した。(1)HCV粒子内RNAの大規模網羅的シークエンス解析を行い、3'UTRにRNAのウイルス粒子内への取り込み効率を高める配列が存在することを確認した。(2)3'UTR配列に対してランダムに変異を導入したレプリコンを用い、感染性粒子産生効率を大幅に低下させる変異を同定した。(3)RNAの二次構造予測を行い、得られた変異が3'UTRの構造を大きく変化させうることを確認した。以上から、同定した変異或はそれに伴うゲノムRNAの構造変化が、感染性粒子産生効率に影響を及ぼすことが示され、その変異周辺の配列がパッケージングシグナルである可能性が示唆された。
2.FRET技術を利用して細胞内のATP濃度を可視化するプローブ(ATeam)を用いて、HCV複製時の複製複合体におけるATPレベルを検証した。これにより、複製を維持した状態でHCV粒子産生・分泌経路を観察可能になると期待できる。本年度は、HCV複製細胞特異的なATeam発現系の構築と検証を行った。(1)HCV複製複合体におけるATPレベルをモニターするために、HCV NS5A蛋白質にATeamを融合した発現系を構築し、複製が維持されることを確認した。(2)共焦点顕微鏡で観察したところ、複製複合体の存在を示唆する顆粒状のFRETシグナルが検出された。以上から、HCV複製複合体においてATPレベルが亢進していることが示唆された。この実験系により、個々のHCV複製細胞中におけるATPの挙動を時間的、空間的に解析することが可能となった。
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