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本研究は、原子間力顕微鏡(AFM)を用いたタンパク質1分子力学計測法を駆使し、タンパク質の機械的安定性やその機能との相関を自由エネルギー地形に基づき定量的に理解することを目的としている。タンパク質1分子力学計測では目的タンパク質を基板-カンチレバー間に強固に結合させる必要がある。固定化には金表面とタンパク質末端部に人工的に導入したシステイン残基とのAu-S結合を利用する方法等が従来からよく用いられてきたが、この方法は内在性システインを含むタンパク質には適さない。そこで、前年度にHaloTagを利用したタンパク質の固定化方法を考案し、1分子伸長実験へと応用した。HaloTagはバクテリア由来のハロアルカンデハロゲナーゼを遺伝子改変して作られた市販のタグタンパク質で、リガンドとの間に安定な共有結合を形成する。我々はリガンドをPEGリンカーを介してマイカ表面に化学修飾し、そこにHaloTag-I27_4融合タンパク質を加え反応させた。1分子力学計測で得られたフォースカーブの解析から融合タンパク質は狙い通りHaloTagとリガンド間の結合により部位特異的に固定化されていることを示した。加えてHaloTagタンパク質のアンフォールディング中間状態を2種類発見した。本年度はデータを集め再現性を確認し、前述の事柄を論文としてLangmuir誌上にて発表した。さらに、内在性システインをもつターゲットタンパク質配列を組み込んだタンパク質発現用コンストラクトの構築と、融合タンパク質発現条件の検討を行った。
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