陽イオンポンプで見出した順次的ATP結合と多重リン酸化:オリゴマー構造と機能調節

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10044048
• 研究種目: 国際学術研究
• 応募区分: 共同研究
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 谷口 和弥 北海道大学, 大学院・理学研究科, 教授 (40028204)
• 研究分担者: SVEN Mardh リンシェピング大学, 生命科学部, 教授 ; JEFFREY Froe 米国国立衛生研究所, 老年学研究センター・兼メリーランド大学・部長, 教授 ; WILHELM Scho ユスタスリービッヒ大学, 生化学・内分泌学, 教授 ; 今川 敏明 北海道大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (20142177) ; 嘉屋 俊二 北海道大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (90186023)
• キーワード: Naポンプ / Hポンプ / リン酸化 / フォスファターゼ / 構造変化

研究概要

膜Na/K-ATPaseの機能的単位が__-protomer、di-protomerさらに高度のprotomerからなるのかに関してのさかんに議論が行われている。我々は豚又は犬腎Na/K-ATPaseのATP又はAcetyl phosphate(AcP)からのsteady stateにおける最大リン酸化酵素(EP)量が、0.5mol/_-鎖である事を発見した。Ouabain結合量/EP量の値はすでに報告したように約2である。豚Na/K-ATPaseを種々の濃度のAP_2PLで処理すると触媒鎖のLys-480の約50%にAP_2PL-probeが結合し、Na/K-ATPase活性を約50%に低下したがそれ以上の結合も顕著な活性の低下も観察されなかった。得られたAP_2PL-enzymeのATPとAcPからのEP量は、それぞれ、約0.25と0.5mol/_-鎖であった。AP_2PL-enzymeをさらにFluorescein5'-isothiocyanate(FITC)で処理すると、約0.9molのFITC-probeがLys-501に結合し、Na/K-ATPaseとATP依存のEP形成能はほとんど消失した。しかしAcPからのEP形成能はほとんど影響をうけなかった。ATPのAP_2PL-FITC-enzymeへの結合量を遠心法で求めた結果は、ATPに対する親和性がほぼ二桁減少したがATP結合能は少なくとも未処理標品の50%以上残存することが示された。Na結合酵素と、K結合酵素にそれぞれATPを添加したさいのAP_2PLとFITC蛍光変化から同一濃度のATPが4種類の構造変化を引き起こすことが明白となった。以上から膜Na/K-ATPaseの機能単位はTetra-protomerであると結論した。

研究成果

• [文献書誌] T.Tsuda: "Fluorescein 5'-Isothiocyanate-Modified Na,K-ATPase at Lys-501 of the α-Chain,Accepts ATP Independent of Pyridoxal 5'-Diphospho-5' Adenosine Modification at Lys-480." J.Biochem.vol.123. 169-174 (1998)
• [文献書誌] T.Imagawa: "Does Binding of Ouabain to Human α1 Subunit of Na,K-ATPase Affect the ATPase Activity of Adjacent Rat α1 Subunit?" Jpn.J.Pharmacal.vol.76. 415-423 (1998)
• [文献書誌] T.Tsuda: "Half-site Modification of Lys-480 of the Na,K-ATPase α-Chain with Pyridoxal 5'-Diphospho-5'-adenosine Reduces ATP-dependent Phosphorylation Stoichiometry from Half to a Quarter" J.Biol.Chem.vol.273. 24334-24338 (1998)
• [文献書誌] T.Tsuda: "ATP and Acetry Phosphate Induce Molecular Events near the ATP binding Site and the Membrane Domain of Na,K-ATPase." J.Biol.Chem.vol.273. 24339-24345 (1998)