バクテリオロドブシンのプロトンポンプ機構

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10044092
• 研究種目: 国際学術研究
• 応募区分: 共同研究
• 研究機関: 姫路工業大学
• 研究代表者: 斉藤 肇 姫路工業大学, 理学部, 教授 (30100150)
• 研究分担者: 神取 秀樹 京都大学大学院, 理学研究科, 助手 (70202033) ; 片岡 幹雄 奈良先端科学大学院大学, 物質創生科学研究科, 教授 (30150254) ; 辻 暁 姫路工業大学, 理学部, 助手 (60227387) ; 内藤 晶 姫路工業大学, 理学部, 助教授 (80172245)
• キーワード: 膜蛋白質 / バクテリオロドプシン / 赤外分光学 / 固体NMR / X線回折

研究概要

バクテリオ口ドプシン(bR)のプロトンポンプ活性機構について、共同研究者であるカリフォルニア大学Lanyi教授、ウエイン州立大学Needeman教授と、変位体タンパク質のデザインおよび調製を軸に、固体高分解能NMR、赤外分光学、X線回折の三つの面からの日米共同研究を行い、ポンプ活性とタンパク質骨格構造変化に関して、以下の結果を得た。
(1) 固体高分解能NMR bRの変異体D85NによりM中間体の室温でのトラップを行い、その^<13>CNMRスペクトルから、Asp85のプロトン化によりレチナールとの相互作用の著しい減少、膜貫通へリックス領域におよぶ大きいコンホメーション変化と、ms-μsオーダーの揺らぎをともなうことを見いだした。さらに、C末端へリックスと細胞質側ループの特異的相互作用、プロトン移動経路における残基のコンホメーション変化を検出した。
(2) 赤外分光学 プロトンポンプの方向性を規定するスイッチが過渡的に存在するかどうかの検証のために、ミリ秒時間領域での構造変化を示すM中間体ついて、偏光赤外分光から後期プロトン移動に関与する水分子の水素結合変化と、スイッチにともなう骨格の構造変化に現れる新しい振動バンドを見いだした。
(3) X線回折 重原子置換法を利用し、I222CにおけるC原子を水銀で修飾し、光中間体の生成にともなうI222の動きを、X線位置投影法で調べた。その結果、I222の位置するGヘリックスのMN中間体における動きは、7A分解能の回折データにおける2A以内であるが、その誤差は実験誤差を大きく凌駕しており、ヘリックスF方向への傾きとして観測できることがわかった。

研究成果

• [文献書誌] S.Yamaguchi: "Stability of C-Terminal α-Helical Domain of Bacteriorhodopsin Protruding from the Membrane Surface as Studied by High-resolution Solid-state ^<13>CNMR" Journal of Biochemistry. 123. 78-86 (1998)
• [文献書誌] H.Saito: "Conformation and Dynamics of Membrane Proteins and Biologcal Active Peptides as Studied by High-resolution Solid-state ^<13>CNMR" Journal of Molecular Structure. 441. 231-242 (1998)
• [文献書誌] A.K.Dioumaev: "Existence of a Proton Transfer Chain in Bacteriorodopsin : Participation of Glu 194 in the Release of Protons to the Extracelluar Surface" Biochemistry. 37. 2496-2506 (1998)
• [文献書誌] Y.Yamazaki: "Interaction of the Protonated Schiff Base with the Peptide Backbone of Valine 49 and the Intervening Water Molecule in the N Photointermediate of Bacteriorhodopsin" Biochemistry. 73. 1559-1564 (1998)
• [文献書誌] H.Kandori: "Polarized FTIR Spectroscopy Distinguishes Peptide Backbone Changes in the M and N Photointermediates of Bacteriorhodopsin" Journal of American Chemical Society. 120. 4546-4547 (1998)
• [文献書誌] H.Kandori: "Cysteine S-H as a Hydrogen Bonding Probe in Proteins" Journal of American Chemical Society. 120. 5828-5829 (1998)
• [文献書誌] T.Oka: "Conformational Change of Helix G in the Bacteriorhodopsin Photocycle : Investigation with Heavy Atom Labeling and X-ray Diffraction" Biophsical Journal. 67. 1018-1023 (1998)
• [文献書誌] S.Nomura: "Ordered Structure Formation of Bacteriorhodopsin-hDHFR in a Plasma Membrane" Langmuir. 51. 214-220 (1999)
• [文献書誌] H.Saito,S.Tuzi and A.Naito: "Annual Report on NMR Spectroscopy,Vol.36" Academic Press,London,UK, 44 (1998)
• [文献書誌] H.Saito,S.Tuzi and A.Naito: "Solid State NMR of Polymers" Elesevior,Amsterdam,The Netherland, 28 (1998)