ヒトSpt4/Spt5複合体と転写装置との相互作用

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10044250
• 研究種目: 国際学術研究
• 応募区分: 共同研究
• 研究機関: 東京工業大学
• 研究代表者: 半田 宏 東京工業大学, フロンティア創造共同研究センター, 教授 (80107432)
• 研究分担者: 和田 忠士 東京工業大学, 生命理工学部, 助手 (60262309) ; BURATAUSKI S ハーバード大学, 医学部, 助教授 ; WINSTON Fred ハーバード大学, 医学部, 教授
• キーワード: DSIF / Spt4 / Spt5 / 転写 / 欠失変異体 / 酵母遺伝学 / 転写装置 / ドミナントネガティブ

研究概要

調査研究実施計画に基づき本年度は、組み換えDSIFp160(ヒトSpt5)の変異タンパク質の作成とヒトSpt5の特異抗体の作成を行い、それらを用いてin vitro転写反応系、GST pulldown法、免疫沈降法、およびファーウェスタン法にまり、次のことを明らかにした。1)ヒトSpt4/Spt5は核内タンパク質である、2)ヒトSpt4とヒトSpt5の結合ドメインを同定した、3)ヒトSpt5とRNAポリメラーゼII(poIII)の結合ドメインを同定した、4)ヒトSpt5のドミナントネガティブ変異体を作成した。さらに、酵母Spt4/Spt5とヒトSpt4/Spt5が機能的に互換性があるかどうか解析するために、酵母でのヒトSpt5の発現ベクターを作成した。ヒトSpt4の発現ベクターは、所有済みである。また、種々の酵母Spt4/Spt5に関する変異体の準備を終えた。よって、来年度はこれらを用いてヒトSpt4/Spt5の機能解析を遺伝学的に進める予定である。一方、転写装置を試験管内で再構成するための基本転写因子群の調整もほとんど終了した。また、基本転写因子群からなる転写系の再構成の過程で、ヒトSpt5/Spt4複合体と機能的に相互作用する新たな転写因子NELF(negative elongation factor)を同定した。NELFはDSIFと協調して働き、poIIIの転写伸長反応を抑制する因子であることがわかった。さらに、NELFとDSIFはpoIIIの最大サブユニットのC-terminaldomain(CTD)が非リン酸化状態のものと結合するが、リン酸化されると結合しなくなることから、NELFとDSIFによる転写伸長反応抑制は、CTDのリン酸化により制御されていることが明らかとなった。

研究成果

• [文献書誌] Y.Yamaguchi,T.Takagi,T.Wada 他5名: "NELF,a multisubunit complex containing RD,cooperates with DSIF to rapress RNA polymerase II elongation." Molecular Cell. 印刷中. (1999)
• [文献書誌] Y.Yamaguchi,T.Wada, 他4名: "Structure and function of the human transcription elongation factor DSIF." J.Biol.Chem.印刷中. (1999)
• [文献書誌] T.Wada,T.Takagi, 他3名: "Evidence that P-TEFb alleriates the negative effect of DSIF on RNA polymerase II-dependent transcription in vitro." EMBO J.17巻24号. 7395-7403 (1998)
• [文献書誌] BR.Cairns, 他4名: "Two actin-related proteins are shared functional compenents of the chromatin-remodeling complexes RSC and SWI/SNF." Mol.Cell. 2巻5号. 639-651 (1998)
• [文献書誌] B.Michel, 他2名: "Histone-like TAFs are essential for transcription in vivo." Mol.Cell. 2巻. 663-673 (1998)
• [文献書誌] EJ.Cho,CR.Moore, 他2名: "Allosteric interactions between capping enzyme suburits and the RNA polymerase II C-terminal domain." Genes Dev.12巻. 3482-3487 (1998)