活性酸素を生成する複合金属フラビン酵素の構造と機能

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10044324
• 研究種目: 国際学術研究
• 応募区分: 共同研究
• 研究機関: 日本医科大学
• 研究代表者: 西野 武士 日本医科大学, 医学部, 教授 (40094312)
• 研究分担者: PAI Emil F. トロント大学, 医学部, 教授 ; 西野 朋子 横浜市立大学, 医学部, 助手 (80075613) ; 松村 智裕 日本医科大学, 医学部, 助手 (20297930) ; 岩崎 俊雄 日本医科大学, 医学部, 助手 (40277497) ; 岡本 研 日本医科大学, 医学部, 助手 (60267143)
• キーワード: キサンチン酸化酵素 / フリーラジカル / 金属フラビン酵素 / 部位特異的変異法 / EPR / NO合成酵素 / X線結晶解析

研究概要

キサンチン酸化酵素はフリーラジカルを生成する複合金属フラビン酵素である。キサンチン酸化酵素に引き続き、日本グループが脱水素酵素型の精製法を改良し結晶化に成功した。その結晶を岡本がカナダへ持参し、回折実験では分解能は2.3Aを示し、良好なnativeデータ収集が得られた。また酸化酵素につきカナダグループと共同で筑波高エネルギー研究所で行い、よりよいデータ収集が行えた。それらの解析は現在進行中である。また日本側ではcDNA発現系を用いて、脱水素酵素型から酸化酵素型への変換に関与するSH基の解析同定を行った。また2つの非ヘム鉄について部位特異的変異法により作成した酵素を用いてそれぞれの同定に成功した。さらにFeSIに配位しているシステイン毎に変異を与え、鉄に対する影響をEPRおよび酸化還元電位測定により調べた結果、FeSIの2つの鉄が同一の性質を示さないことが知られた。さらに発現系を大腸菌にて行うための試みを松村がカナダにて行った。類似の複合金属フラビン酵素NO合成酵素につき、各種分光学的解析を用い解析を進めたと同時に岩崎が電子顕微鏡による構造解析を短期間カナダで進めた。日本側では種々の変異酵素につき物理化学的性質の解析を開始し、ヘム結合周囲の構造機能相関につき理解を進めた。また天然に存在が知られる変異酵素を大腸菌による発現系により発現させ、その性質の検討を行った。また、脂質による阻害を見い出しその作用部位と作用様式を蛋白化学的、反応速度論的に検討した。さらに比較のため類似複合金属フラビン酵素であるセロピオース脱水素酵素につきフラピンドメイン、ヘムドメインを分離しそれぞれを解析した。現在結晶化を試みている。

研究成果

• [文献書誌] Ichida K.Kamatani N.Nishino T.Saji M.Okabe H.Hosoya T.: "Mutations in xanthine dehydrogenase gene in subjects with hereditary xabthinuria." Adv.Exp.Med.Biol.431. 327-330 (1998)
• [文献書誌] N.Nagahara,Ito T,Kitamura H.and T.Nishino: "Tissue and subcellular distribusion of mercaptopyruvate sulfur transferase in rat." Histochem.Cell Biol.10. 243-250 (1998)
• [文献書誌] Otsubo,Y.,Hori,H.,Nishino,T and Araki,T.: "Comparison of nitric oxide synthase in normal human placenta from 37 to 41 weeks gestation." J.Maternal-fetal Inves.8. 139-144 (1998)
• [文献書誌] K.Igarashi,M.Verhagen,M.Samejima,M.Schulein,K.L.Eriksson and T.Nishino.: "Cellobiose dehydrogenase from the fungi Phanerochaete chrysoporium and Humicola insolens." J.Biol.Chem.274. 3338-3344 (1999)
• [文献書誌] K.Ichimori,M.Fukahori,H.Nakazawa,K.Okamoto and T.Nishino: "Inhibition of xanthine oxidase and xanthine dehydrogenase by nitric oxide." J.Biol.Chem.274. 7763-7768 (1999)
• [文献書誌] T.Iwasaki,H.Hori,Y.Hayashi,T.Nishino,: "Modulation of the remote heme site geometry of recombinant mouse neuronal nitric oxide synthase by the N-terminal hook region." J.Biol.Chem.274(in press).
• [文献書誌] T.Iwasaki,H.Hori,Y.Hayashi,T.Nishino,K.Tamura,S.Oogami,T.Iizuka,T.Ogura and H.Esumi:"Characterization of nNOS,a natural valiant of neuronal nitric oxide synthase constitutively produced in mouse brain by selective alternative splicing." J.Biol.Chem.274(in press).