活性酵素を生成する複合金属フラビン酵素の構造と機能

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10044324
• 研究機関: 日本医科大学
• 研究代表者: 西野 武士 日本医科大学, 医学部, 教授 (40094312)
• 研究分担者: 松村 智裕 日本医科大学, 医学部, 助手 (20297930) ; 岡本 研 日本医科大学, 医学部, 助手 (60267143) ; 岩崎 俊雄 日本医科大学, 医学部, 講師 (40277497) ; 西野 朋子 横浜市立大学, 医学部, 助手 (80075613)
• キーワード: X-線結晶解析 / キサンチン脱水素酵素 / キサンチン酸化酵素 / フラビン酵素 / 非ヘム鉄 / モリブデン酵素 / 活性酸素 / スーパーオキシド

研究概要

すでに作成してあるキサンチン酸化酵素に引き続き、脱水素酵素型の精製法を改良し結晶化に成功した。結晶は放射光施設にて最高分解能1.7Åの回折が得られた。その結晶の良質さ故に、キサンチン酸化酵素では解けなかった立体構造が2.1Åまでのデータセットを基にMAD法、フラビンのない非ヘムモリブデン酵素であるアルデヒド酸化還元酵素の立体構造を用いたMR法を併用して構造が解かれた。現在第一報の論文を投稿中である。補欠分子族であるモリブデン、二つの非ヘム鉄およびフラビンは一列に並び、それぞれの距離は14、12.5、7.8Åであった。詳細は現在論文執筆中である。脱水素酵素型の立体構造をもとにキサンチン酸化酵素の立体構造もMR法により2.5Å分解能でとかれた。フラビン周囲の構造はNADが近付き難い構造が酸化酵素ではみられ、いままでの推測を裏付けた。さらに二つの酵素型でセミキノンの安定性を説明できる周囲環境静電的な差異が見られた。またcDNA発現系を用いて、脱水素酵素型から酸素酵素型への変換に関与するSH基の解析同定を行った。また2つの非ヘム鉄についてEPR、酸化還元電位および一次構造モチーフ上それぞれ異なる2つのタイプ(FeS I,FeS II)が知られているが、部位特異的変異法により作成した酵素を用いてそれぞれの同定に成功した。さらにFeS Iに配位しているシステイン毎に変位を与え、鉄に対する影響をEPRおよび酸化還元電位測定により調べた結果、FeSIの2つの鉄が同一の性質を示さないことが知られた。この違いはXー線構造上の二つの鉄の位置関係から説明できた。すなわち影響を受けた鉄は距離上もう一方の鉄に比べより至近距離にあり電子伝達には二つの鉄の一方のみが関与していることを示唆している。

研究成果

• [文献書誌] K.Igarashi,M.Verhagen,M.Samejima,M.schulein,K.L.Eriksson and T.Nishino: "Cellobiose dehydrogenase from the fungi Phanerochaete chrysoporium and Humicola insolens; A flavoprotein from Humicola insolens contains 6-hydroxy-FAD as the dominant active cofactor."J. Biol. Chem.. 274. 3338-3344 (1999)
• [文献書誌] K.Ichimori,M.Fukabori,H.Nakazawa,K.Okamoto and T.Nishino: "Inhobition of xanthine oxidase and xanthin dehydrogenase by nitric oxide; nitric oxide converts reduced xanthine oxidizing enzymes into the desulfo-type inactive form."J. Biol. Chem.. 274. 7763-7768 (1999)
• [文献書誌] T.Iwasaki,H.Hori,Y.Hayashi,T.Nishino: "Modulation of the remote heme site geometry of recombinant mouse neuronal nitric oxide synthase by the N-terminal book region."J. Biol. Chem.. 274. 7705-7713 (1997)
• [文献書誌] T.Iwasaki,H.Hori,Y.Hayashi,T.Nishino,K.Tamura,S.Oogami,T.Iizuka,T.Ogura and H.Esumi: "Characterization of nNOS, a natural valiant of neuronal nitric oxide synthase constitutively produced in mouse brain by selective alternative splicing."J. Biol. Chem.. 274. 17559-17566 (1999)
• [文献書誌] T.Iwasaki,K.Okamoto,T.Nishino,J.Mizushima,H.Hori, and T.Nishino: "Sequence Motif-specific Assignment of Two[2Fe-2S] Clusters in Rat Xanthine Oxidoreductase by Site-directed Mutagenesis"J. Bichem.. (in press).
• [文献書誌] C.Enroth,B.T.Eger,E.F.Pai,K.Okamoto,T.Iwasaki,T.Nishino, and T.Nishino: "Favins and Flavoproteins(S.Ghisla et al, eds.): Crystal structure of xanthine oxidoreductase and EPR assignment of Fe/S center."RUDOLF WEBER AGENCY FOR SCIENTIFIC PUBLICATIONS. 4 (1999)
• [文献書誌] T.Nishino,K.Okamoto,H.Hori,A.Kounosu,T.Nishino: "Favins and Flavoproteins(S.Ghisla et al, eds.): The Mechanism of Conversion from Xanthine Dehydrogenase to Oxidase of Rat Enzyme Studied by Site-Directed Mutagenesis."RUDOLF WEBER AGENCY FOR SCIENTIFIC PUBLICATIONS. 4 (1999)