一酸化窒素合成酵素の電子伝達機構の解明

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10045076
• 研究種目: 国際学術研究
• 応募区分: 大学協力
• 研究機関: 東海大学
• 研究代表者: 中澤 博江 東海大学, 医学部, 教授 (20110885)
• 研究分担者: ABU・SOUD Hus ケースウエスタンリザーブ大学, 医学部, 主任研究員 ; IKEDAーSAITO マサオ ケースウエスタンリザーブ大学, 医学部, 教授 ; STUEHR Denni ケースウエスタンリザーブ大学, 医学部, 教授 ; 石田 英之 東海大学, 医学部, 講師 (20222424) ; 一守 康史 東海大学, 医学部, 講師 (60184636)
• キーワード: 一酸化窒素 / NO合成酵素 / テトラバイオオプテリン / アルギニン / ヘム / NADPH

研究概要

NOは細胞内外の情報伝達物質として生理的に働く一方、敗血症時やグルタミン酸誘発神経細胞死のように各種細胞におけるNOの過剰産生が細胞障害を誘発すると考えられてきた。この多面的なNOの作用は生体内各種細胞に選択的に発現した三種のNO合成酵素(NOS)によって実現されている。本研究の目的は、3種のNOSにおいてNO合成酵素の酸化酵素ドメイン(Hemeドメイン)、還元酵素ドメイン、テトラハイドロバイオプテリンの相互の結合機構を明らかにし、基質としてのL-Arginineと電子供与体としてのNADPHの結合部位を同定し、電子伝達の過程を明らかにすることである。1998年5月から、一守康史がケースウエスタンリザーブ大学(米国、オハイオ州)のDr.Stuehrの研究室に滞在し、ラットのnNOSとeNOSのDNAを増殖後環状DNAとし大腸菌に導入、大量のnNOS.iNOS.eNOSを得た。これを精製後、NOS全領域のNADPH酸化活性における補酵素BH4とその類縁化合物の効果を検討した。この検討により、
1. NOS内の還元酵素領域におけるNADPHによるフラピンの還元は3種の酵素で大きな相違はない。
2. 還元酵素領域から酸化酵素領域への酵素内電子伝達速度が3種3様である。通常状態ではbNOSが最も速いが、それが補欠分子族であるカルモジュリンおよびビオプテリンの種類、結合力によって大きく左右される。iNOSではビオプテリンによって多少速度が左右されるものの安定して高速な電子伝達を行う。一方、eNOSでは、最も好条件でもその電子伝達速度がbNOSの1/7以下であった。
3. Tumover時におけるの実質的NO生成速度はiNOSが最も速い。というのは、bNOSは最も電子伝達速度が速いが、生成したNOが強く自身の還元型ヘムに結合してニトロシルヘムを生成して自己抑制をかけてしまう一方で、iNOSはニトロシルヘムを生成するがヘム自身は3価でbNOSのものほど安定でないため、自己抑制がbNOSほどかからないためであった.eNOSは電子伝達速度が遅いためにそれがNO生成の律速段階となり、ニトロシルヘムの生成は検出されない。
以上より、3種のNOSにおいてはそのNOによる自己抑制、分子内電子伝達制御といったNO生成制御の様式は全く異なっている。iNOSは酵素の誘導のみで制御されるという旧来の見方を支持するように酵素学的に外部の摂動を受けにくい構造になっており、bNOS、eNOSはそれぞれが外部刺激に対応して自身が必要な量のNOを生成するという目的に適ったkineticsを示すことが明らかになった。

研究成果

• [文献書誌] Ichimori K: "Inhibition of Xanthine oxidase and xanthine dehydrogenase by nitric oxide." J Biol Chem. (in press).
• [文献書誌] Honda K: "Inhaled nitric oxide reduces tyrosine after LPS instillation in Lung Tissue of Rats." Am J Resp Crit Care Med. (in press).
• [文献書誌] Takizawa S: "Dynamics of nirotyrosine formation and decay in rat brain during focal ischemia." J Cerebr Blood F Met. (in press).
• [文献書誌] Hoshiai M: "Impaired sarcoplasmic reticulim function in lipopolysaccharide-induced myocardial dysfunction." Shock. (in press).
• [文献書誌] Momii H: "Inhibition of adhesion molecules Markedly Ameliorates cytokine-induced sustained myocardial dysfunction in dogs in vivo." J Mol Cell Cardiol. 30. 2637-2650 (1998)
• [文献書誌] Fukuyama N: "Peroxynitrite formation in focal cerebral ischemia-reperfusion in rat occurs predominantly in the peri-infarct region." J Cereb Blood Flow Metab. 18. 123-129 (1998)
• [文献書誌] Ito K: "A microangiographic technique using synchroton radiation to visualize dermal circulation in vivo." Plastic and Reconstructive Surgery. 102. 1128-1133 (1998)
• [文献書誌] Ishida H: "Application of authenic peroxynitrite to blological materials." Methods Enzymol. 301. 402-409 (1998)
• [文献書誌] Zhi Su: "Peroxynitrite is not major mediator of endotherial cell injury by activated neutrophils in vitro." Cardiovasc Res. 39. 485-491 (1998)
• [文献書誌] Adachi T: "Inhibition of nitric oxide synthesis aggravates myocardial ischemia in hemorrhagic shock in constant pressure model." Shock. 9. 204-209 (1998)
• [文献書誌] Sato M: "Increased nitric oxide in nasal lavage fluid and nitrotyrosin formation in nasal mucosa--Indices for sever perennial nasal allergy." Clin Exp Allergy. 28. 597-605 (1998)
• [文献書誌] Oyama J: "Role of nitric oxide and peroxynitrite in the cytokine-induced sustained myocardial dysfunction in dogs in vivo." J Clin Invest. 101. 2207-2214 (1998)
• [文献書誌] Tsuji C: "The importance of polymorphnuclear leukocytes in lipopolysaccharide-induced superoxide anionproduction and lung injury." Lung. 176. 1-13 (1998)
• [文献書誌] 源河朝広: "続心臓代謝実験法" 六法出版社, 9 (1998)
• [文献書誌] 星合清隆: "抗酸化物質のすべて" 先端医学社, 7 (1998)
• [文献書誌] Ishida H: "The Ischemic Heart" Mochizuki S,Takeda N,Nagano M,Dhalla NS, 16 (1998)
• [文献書誌] Tanaka Y: "Medical Applications of Synchrotron Radiation" Ando M,Uyama C, 5 (1998)
• [文献書誌] Ishida H: "Pathophysiology of Lipid Peroxides and Related Radicals" Yagi K, 17 (1998)
• [文献書誌] 広田有希: "磁気共鳴と医学9" 日本医学館, (1998)