部位特異的変異法によるNO合成酵素の電子移動機構と酸素分子活性化機構の解明

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10129201
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 清水 透 東北大学, 反応化学研究所, 教授 (40118956)
• 研究分担者: 佐藤 秀明 東北大学, 反応化学研究所, 助手 (60271996) ; ダフ サイモン 東北大学, 反応化学研究所, 助手 (50292298) ; 佐上 郁子 東北大学, 反応化学研究所, 講師 (10143033) ; 伊藤 攻 東北大学, 反応化学研究所, 教授 (30006332)
• キーワード: 一酸化窒素 / P450 / 酸素活性化 / 自動酸化速度 / アルギニン / プテリン / 一酸化窒素合成酵素 / ヘム酵素

研究概要

生体内において極めて重要な働きをする伝達物質、一酸化窒素NO、をアルギニンから合成する神経型NO合成酵素(以下NOSと略す)の構造一機能相関、特に電子伝達及び酸素分子活性化の機構について研究した。
1. NOSはL-Argから2段階の一酸素添加反応を経てNOを合成する。NOSはP450型ヘムを活性部位に保持している。NOSにおいても、P450と同様にAsp/Glu及びThrがO-O解裂に関与しているのではないかと考えて、神経型NOSで良く保存されたAsp314,Thr315を変異させて、それら変異体の反応活性を調べた。これら変異体の反応活性はP450の対応する変異体の挙動と非常に良く似たものであった。
2. 神経型NOSの自動酸化速度を始めて測定した。自動酸化速度は3相より成っていた。この速度は、誘導型NOSの酸化酵素ドメインの自動酸化速度にくらべて2桁速かった。基質のL-Argやそれに類似した阻害剤の添加によって、特に、第1相及び第2相の酸化速度は著しく低下した。プテリンは第2相の割合を著しく増加させた。いっぽう、プテリンの存在下、基質や阻害剤によって酸化速度は変化しなかったが、反応中間体であるOH-L-Argによって第1相の酸化速度は著しく低下した。これらのことより、(1)L-Argは酸素結合型NOSを安定化する。(2)プテリンは酸素結合型NOSの自動酸化速度に影響を与えるが、その効果は、基質、阻害剤、中間体とは異なる。(3)中間体は自動酸化速度に基質とは異なる効果を与える。が示唆された。

研究成果

• [文献書誌] Sagami,I.,Shimizu,T.: "The Crucial Roles of Asp314 and Thr315 in the Catalytic Activation of Molecular Oxygen by Neuronal Nitric-oxide Synthase" J.Bio.Chem.273. 2105-2108 (1998)
• [文献書誌] Sato,H.,Shimizu,T.: "CO Binding Studies of Nitric Oxide Synthase:Effects of the Substrate,Inhibitors and Tetrahydrobiopterin" FEBS Letters. 430. 377-380 (1998)
• [文献書誌] Nakano,K.,Shimizu,T.: "Chiral Recognition at the Heme Active Site of Nitric Oxide Synthase is Markedly Enhanced by L-Arginine and Tetrahydrobiopterin" Biochem.Biophys.Res.Commun.248. 767-772 (1998)
• [文献書誌] Sato,H.,Shimizu,T.: "Autoxidation Rates of Neuronal Nitric Oxide Synthase:Effects of the Substrates,Inhibitors,and Modulators" Biochem.Biophys.Res.Commun.253. 845-849 (1998)