金属錯体抗生物質・センサー蛋白質による遺伝子発現制御機構

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10129223
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 杉山 政則 広島大学, 医学部, 教授 (30106801)
• 研究分担者: 熊谷 孝則 広島大学, 医学部, 助手 (70274058) ; 大谷 和弘 広島大学, 医学部, 助教授 (20203820)
• キーワード: X線結晶構造解析 / 金属錯体 / 抗生物質 / ブレオマイシン / ブレオマイシン結合蛋白質 / 大腸菌 / 蛋白質の結晶化

研究概要

平成10年度は、Tn5由来のブレオマイシン(Bm)耐性遺伝子産物(BLMTと命名)の性質を調査するため、先ず、大腸菌のホスト・ベクター系を用いてBLMTの大量発現系を確立した。さらに、BLMTを精製し、本蛋白質がBmを特異的に認識し、Bmに結合する蛋白質であることを明らかにした。
一方、Tn5由来のBm耐性遺伝子bleを大腸菌に導入すると、非導入に比べ、宿主大腸菌が長く生存できる(survival advantageと命名)ことを見い出した。さらに、site-directed mutagenesis法を用いて、BLMTの7番目のProlineをLeucineに置換することで、Bm結合能を失わせた変異BLMTを作成した。この変異型BLMTを産生する大腸菌の生存能を調べた結果、野生型BLMTを産生する大腸菌と同等のsurvival advantageが付与された。この結果はBLMTのBm結合能とsurvival advantageを付与する能力は非依存的であることを示す。
次に、BLMTのX線結晶構造解析をするため、その結晶化を行い、予備的なX線結晶構造解析を試みた。その結果、本結晶は斜方晶系に属し、空間群C222_1、格子定数はa=81.56,b=85.25,c=78.91Åであった。回折強度データの収集をPhoton FactoryのBL18Bにて波長1.0Åで行った結果、1つの結晶から2.0Å分解能での完全なデータセットを収集できた。得られたデータセットのR_<merge>は0.052、完全性は90.6%であった。
BLMTの構造解析は分子置換法にて行った。その初期モデルをX-PLORを用い精密化を行った結果、2.0Å分解能での最終モデルは、水分子90個を含み、R=19.3%,R_<free>=25.8%となった。得られたBLMTの三次元構造は、主鎖のホールディングにおいて、BLMAとほぼ同じであった。

研究成果

• [文献書誌] Kumagai,T.: "Crystarization and preliminary X-ray diffraction studies of bleomycin-binding pretein encoded on the transposon Tn5" Acta Cryst.Sec.D. (in press). (1999)
• [文献書誌] Kumagai,T.: "Characterization of the bleomycin resistance determinant encoded on the transposon Tn5" FEBS lett.442. 34-38 (1999)
• [文献書誌] Ishikawa,Y.: "Oxidative and random cleavage of DNA by the novel iron (II) complex capable of yielding an iron (III) hydroperoxide intermediate" Chem.Lett.39-40 (1998)
• [文献書誌] Nishimura,M.: "Purification and characterization of a puromycin-hydrolyzing enzyme from blasticidin S-producing Streptomyces morookaensis" J.Biochem.123. 247-252 (1998)
• [文献書誌] Kumagai,T.: "Protection of mammalian cells from the toxicity of bleomycin by expression of a bleomycin-binding protein gene from Streptomyces verticillus" J.Biochem.124. 835-841 (1998)
• [文献書誌] Ikeda,K.: "Construction of a new cloning vector utilizing a cryptic plasmid and the highly expressed melanin-synthesizing gene operon from Streptomyces castaneoglobisporus" FEMS Microbiol.Lett.168. 195-199 (1998)
• [文献書誌] Kumagai,T.: "Crystallisation and preliminary X-ray diffraction studies of bleomycin-binding protein from bleomycin-producing Streptomyces verticillus" Acta Cryst.Sec.D. 54. 127-128 (1998)