末端酸化酵素の基質酸化特異性とプロトン輸送能の研究

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10129225
• 研究機関: 九州工業大学
• 研究代表者: 曽根 専史 九州工業大学, 情報工学部, 教授 (20049034)
• 研究分担者: 野口 俊介 九州工業大学, 情報工学部, 助手 (30222194) ; 坂本 順司 九州工業大学, 情報工学部, 助教授 (80175364)
• キーワード: シトクロムオキシダーゼ / ヘム銅末端酸化酵素 / 呼吸鎖 / ヘムO / Bacillus stearothermophilus / プロトンポンプ / 大量発現 / シトクロムc-551

研究概要

bo_3型シトクロムオキシダーゼ この酵素はヘムBとOのほか少量のヘムAを含みこの菌のシトクロムc-551を高い親和性で速く酸化することができるので(Km=0.2uM,Vmax=190s^<-1>)、この酵素は2つのサブユニット(56と20kDa)からなるが、その一次構造から見ても、グラム陰性非プロテオバクテリアのThermus thermophilusのba_3型酸化酵素と類似している。これら2つのb(o/a)_3型酸化酵素のサブユニットIIには、古細菌Sulfolobus acidocaldariusで同定されたSoxABCDキノール酸化酵素のそれとともに膜貫通a-ヘリックスが1本しかない(他のほとんどのヘム銅オキシダーゼは2本)。この好熱性バシラスのシトクロムbo_3をふくむsoxBグループは系統樹の上で,おおくのaa_3型のオキシダーゼがふくまれるsoxM型やNO還元酵素との類似性をしめすfixN型とは異なる独自のサブグループを形成する。.B.stear other mophilus野生株K-1041に酵素のオペロンを持つプラスミドを形質転換したところ1-2nmol/mg proteinの本酵素が発現された。また同様のオペロンを持つ大腸菌プラスミドを大腸菌で発現させたところ、1〜2nmol/mg proteinの酵素が発現された。前者にはシトクロムcオキシダーゼ活性があったが後者にはなかったので、前者から精製をすすめ、DEAEセルロースとハイドロキシアパタイトカラムによりほぼ純粋にした。このbo_3型オキシダーゼは2個の基質結合部位を持ち、その高親和性部位にシトクロムc-551を特異的に結合する。一方、低親和性部位の基質特異性は低い。また、低いながらもH^+ポンプ活性を検出することができた。
変異シトクロムc-551 このbo_3型オキシダーゼの本来の基質であるシトクロムc-551部位特異性変異を導入し、5種の変異シトクロムc-551を発現し、これらを精製した。
ctaA遺伝子 B.stear other mophilusのcaa_3型オキシダーゼの構造遺伝子の上流反対ストランドにあるctaAを大腸菌で発現、ヘムOオキシゲナーゼであることを示した。
cb型オキシダーゼ 第三のヘムー銅オキシダーゼであるcb型オキシダーゼをHelicobacter pyloriから精製しその性質を調べた。

研究成果

• [文献書誌] Nikaido,K.,Noguchi,S.,Sakamoto,J.,and Sone,N.: "The cbaAB genes for bo3-type cytochrome c oxidase in Bacillus stearothemophilus" Biochim.Biophys.Acta. 1397. 262-267 (1998)
• [文献書誌] Tsukita,S.Koyanugi.S,Nagata,K.Koizumi,H.,Arashi,H.Shigayama,T.Tamura,T.Sina Sone,N: "Expression and use of Methanobacterium thermoautotrophicumsn-glycerol 1-phosphate dehydrogenase for the assay of sn-glycerol 1-phosphate in Arehaea" J.Ferm.Bioengine.86. 266-270 (1998)
• [文献書誌] Noguchi,S.Kai,K.Sone,N.: "Caracterization of a cb-type cytochrome c oxidase from Helicobacter pylori" J.Biochem.125. 194-201 (1999)
• [文献書誌] Sakamoto,J.Hayakawa,A.Uehara,T.Noguchi,S.and Sone,N: "′Cloning of Bacillus stear other mophilus ctaA and heme A synthesis with tha ctaA protein produced in Escherichia coli" Biosci.Biotechnol.Biochem.63. 96-103 (1999)
• [文献書誌] Tsukita,S Sakamoto,J.,and Sone,N.: "Derect cor elationship between proton translocation and growth yield,an analysis on the respiratory chain of Bacillus stear other mophilus and its mutant" J.Biosci.Bioengine.87-4(in press). (1999)
• [文献書誌] Sakamoto,J.Koga,E.Mizuta,T.Sato,C.,Noguchi,S & Sone,N.: "Gene structure and quinol oxidase activity of a cytochrome bd-type oxidaae from Bacillus stearothermophilas" Biochim.Biophys.Acta. 44725. 1-12 (1999)