エンド型グリコシダーゼを用いた糖鎖の再構築とその再構築糖鎖のタンパク質への導入

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10134203
• 研究機関: 弘前大学
• 研究代表者: 遠藤 正彦 弘前大学, 医学部, 教授 (20004616)
• 研究分担者: 棟方 秀和 弘前大学, 医学部, 助手 (80271807) ; 高垣 啓一 弘前大学, 医学部, 助教授 (70163160)
• キーワード: エンド型グリコシダーゼ / 糖鎖再構築 / 糖鎖のタンパク質への導入 / 生理活性ドメイン / 糖鎖導入のキャリヤー / 4-メチルウンベリフェロン誘導糖鎖 / 糖鎖組み換え / ヒアルロニダーゼ

研究概要

1. 研究の目的:遺伝子工学的に産生されるリコンビナントタンパク糖鎖欠損の輪という欠点を補うため、プロテオグリカンをモデルに、エンド型グリコシダーゼの糖転移活性を利用して、天然のグリコサミノグリカンから生物活 性を有する糖鎖に組み換え、これをリコンビナントのタンパク質に導入する方法を確立する。
2. 研究の成果:1)エンド型グリコシダーゼとしてのヒアルロニダーゼを用いた糖転移活性の至適条件、糖鎖の供与体及び受容体の条件が既に検討されているが、これを補充し、確立した。2)任意にデザインされた糖鎖配列を、組み換え法で作製する条件が検討された。その結果、(1)ヒアルロン酸とコンドロイチン硫酸かも非天然型の糖鎖が、(2)コンドロイチン硫酸と脱硫酸化デルマタン硫酸から天然の各種のドメイン構造の基本的糖鎖の組み換えが可能になった。3)ヒアルロニダーゼにより産生された組み換え糖鎖の化学構造を決定する方法の一つとして、質量分析装置により、糖鎖の還元末端糖鎖を同定する方法が確立された。4)糖鎖をペプチドへ導入するためのキャリヤーが検討された。培養細胞の培地に4-メチルウンベリフェリル.β-キシロシドを添加して培養すると、これをプライマーとして伸長する糖鎖が有効であった。5)糖鎖のタンパク質への導入に有効なエンド-β-キシロシダーゼのクローニングに向けての精製が進んでいる。
3. 今後の課題:生物活性を有するより複雑な糖鎖構造を作製するために、糖鎖中により過剰な硫酸基の導入方法の確立、及び糖鎖をタンパク質に位置選択的に導入する方法の検討が必要である。

研究成果

• [文献書誌] Takagaki,K.: "Effect of monensin on the synthesis of β-D-xyloside-induced glycosaminoglycan and its likage region oligosaccharides in human skin fibroblasts." J.Biochem.122. 1129-1132 (1997)
• [文献書誌] Yasukochi,T.: "Enzymatic synthesis of 4-methylubelliferyl glycosides of trisaccharide,and core tetrasaccharide,Gal(β1-3)Gal(β1-4)Xyl and GlcA(β1-3)Gal(β1-3)Gal(β1-4)Xvl,corresponding to the linkage region of proteoglycans." Bull.Chem.Soc.Jpn.70. 2719-2725 (1997)
• [文献書誌] Takagaki,K: "Ion-spray mass spectromentry for identification of the nonreducing terminal sugar of glycosaminoglycan." Glycobiology. 8. 719-724 (1998)
• [文献書誌] Takagaki,K.: "Characterization of β-D-xyloside-initiated glycosaminoglycan synthesized by human skin fibroblasts in the presence of tunicamycin." Glycoconjugate J.15. 483-489 (1998)
• [文献書誌] Tazawa,T.: "A novel 4-methylumbelliferyl-β-D-xyloside derivative,sulfate-O-3-xylosyl β1-(4-methylumbelliferone),isolated from culture medium of human skin fihroblasts,and its role in 4-methylumbelliferone-initiated glycosaminoglycan biosynthesis." Glycobiology. 8. 879-884 (1998)