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近接場照明を使って、タンパク質1分子の酵素反応を可視化し、それに共役しておこる物理反応(回転、滑り運動)を同時にイメージングすることを目的にして研究を遂行した。近接場照明を生体試料の蛍光観察に応用するときには、試料のガラス表面への固定が問題となってくる。生きたままの試料を観察するために必要な条件として蛋白質分子への影響が少ないことがあげられる。また、強固に結合していることや、取り扱いやすいことなども重要な点である。本年度は、これらの条件を満たす方法としてHis-Tagを用いた蛋白質分子のガラス表面への固定方法を試みた。ガラス表面にNi-NTAを結合させるために、ガラス表面にSH基を導入したあと、アミノ基の結合したNTA(AB-NTA、同仁)を結合させた。ATP加水分解酵素F1をHis-Tagを使用してガラス表面に固定し、その回転運動を観察した。大腸菌F1のaサブユニットに遺伝子工学の手法を用いてHis-Tagを導入した。gサブユニットに導入したシステインはビオチン化の後、ストレプトアビジンを介してビオチン化蛍光標識アクチンフィラメントと結合させた。スペーサーとなる蛋白質を介さずに、直接Ni-NTAをガラス表面に結合させても、F1の活性は失われていなかったことを示す。また、回転速度のアクチンフィラメント長さ依存性を計測し、F1の回転トルクを計測したところ、いままで報告されている値とほぼ同様な値が得られた。
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