NF-AT制御機能の解明

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10167228
• 研究機関: (財)東京都臨床医学総合研究所
• 研究代表者: 芝崎 太 財団法人東京都臨床医学総合研究所, 微生物研究部門, 研究員 (90300954)
• 研究分担者: 大森 信彦 財団法人東京都臨床医学総合研究所, 微生物研究部門, 研究員 (80311421)
• キーワード: カルシニューリン / NF-AT / casein kinase I / MEKKI / nPKC / NF-ATキナーゼ / 核移行 / NLS

研究概要

1) NF-ATキナーゼの同定:NF-ATは静止時の細胞においてはN-端半分のserine clusterがリン酸化され、キナーゼがこれらの部位をターゲットしていることが予想されたため、GST-NFAT-N端の融合蛋白を大腸菌にて発現させ、アフィニティーカラムを作製した。HeLa細胞のl%TritonX-100抽出分画を用いて、このカラムにて結合するキナーゼを精製し、アミノ酸分析の結果、それぞれprotein ki-naseC(PKC)ηおよびcasein kinase Iα(CKI)であることが判明した。さらにMAPK系の各キナーゼの恒常活性型変異体を用いて、NF-ATの核内移行阻害活性を調べたところ、MEKKIが最も強く、NF-ATキナーゼの1つであることが判明した。
2) CKIとMEKKIによるNF-ATの調節機序:NF-ATキナーゼとして同定されたPKCη、CKIα、MEKKlの遺伝子を発現ベクターに組み込みBHK細胞にて解析を行った。 CKI、MEKKIはNF-ATを直接リン酸化したが、興味深いことにまず、MEKKIがN-端にあるA domainのserineをリン酸化した後(priming phosphorylation)、このリン酸化に誘導されCKIがAdomainに結合し、さらに多くのserine残基をリン酸化すること(main phosphorylation)が判明した。NF-ATには3ヶ所の核移行シグナル(NLS)配列があり、このNLSについて活性化機序を調べたところ、A,Bdomainの間にある3-4個のserineのリン酸化部位を含む20-30アミノ酸配列(Zdomain)がNLSに結合し、分子内NLSmaskingを起こす。カルシニューリンのCdomainへの結合は脱リン酸化によるZdomainの脱リン酸化を惹起し、NLSの露出による核内移行シグナルの開始という一連のカスケードが働いていることが明らかとなった。
3) CKIとnPKCによるNF-ATの調節機序:PKChおよびCKIの特異性を調べるためPKCの各サブタイプおよびCKI、CKIIについて検討したところ、NF-ATキナーゼ活性はCKIIには殆どなくCKIが非常に強く、またPKCのサブタイプの内nPKCにあたるPKCηとPKCθのみがNF-AT核移行阻害活性を持っていた。PKCηおよびPKCθは直接NF-ATをリン酸化しないものの核内移行阻害活性は強く、詳細を検討した結果、CKIを特異的にリン酸化し結合する際にNF-AT/CKI複合体を骨格系分画ヘトラップすることが判明した。この事実はnPKC活性化シグナルがCKIを介してNF-ATを負に制御している可能性を示唆しており、nPKCを活性化する上流の伝達系や受容体の存在は、T細胞活性化を抑制する情報伝達系を解明する上で重要であり、今後詳細を解析する予定である。

研究成果

• [文献書誌] Zhu,J.,Shibasaki,F.,et al.: "Intramolecular masking of nuclear import signal on NF-AT4 by casein kinase I and MEKKI." Cell. 93. 851-861 (1998)
• [文献書誌] Shibasaki,F.: "A new aspect of serine/threonine phosphatase 2B calcineurin." J.Biochem. (発表予定). (1999)
• [文献書誌] Wang,HーG.,Pathan,N.,Shibasaki,F.,et al.: "Calcineurin promotes cell death by dephosphorylating BAD" Science. (発表予定). (1999)
• [文献書誌] Shimoyama,M.,Komuro,I.et al.: "Calcineurin plays a critical role in pressure overload-induced cardiac hypertrophy." J.Clinic.Invest.(発表予定). (1999)
• [文献書誌] 芝崎 太: "カルシニューリンとBcl-2の相互作用および情報伝達系との関わり" 臨床免疫. 30. 689-696 (1998)
• [文献書誌] 芝崎 太: "カルシニューリンの新たな展開:神経細胞死制御" 脳の科学. 20. 203-208 (1998)
• [文献書誌] 大森信彦、芝崎 太: "カルシニューリンによる転写因子調節、NFーATの機能制御を中心に" 蛋白質 核酸 酵素. 43. 1047-1054 (1998)
• [文献書誌] 下重美紀、芝崎 太: "Ca^<2+>と動態;カルシウム/カルシニューリンを介するアポトーシス制御機構" 蛋白質 核酸 酵素(臨時増刊号). 43. 1877-1883 (1998)
• [文献書誌] 近藤英作、芝崎 太: "Bcl-2によるアポトーシス制御機構の新たな展開;カルシニューリンはBcl-2の機能制御因子である" 実験医学. 16. 1253-1258 (1998)
• [文献書誌] 芝崎 太: "カルシニューリンの脳における新たな展望" 神経精神薬理. 16. 205-208 (1998)
• [文献書誌] 瀬戸口 るり、芝崎 太: "CTLA-4(CD152)からのシグナル" 臨床免疫. (発表予定). (1998)