細胞内情報伝達ネットワーク研究のための2光子励起法適用可能な機能探索分子

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10169229
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 中山 晋介 名古屋大学, 医学部, 助教授 (30192230)
• 研究分担者: 久場 健司 名古屋大学, 医学部, 教授 (60080561)
• キーワード: 2光子励起 / イメージング / ケイジ化合物

研究概要

1) 2光子励起イメージングの目的のために、適当なCa感受性色素の探索を行った。超短パルスレーザー光波長を適当にかえて、各種Ca感受性色素の励起波長特性を測定したところ、Oregon Green BAPTA-1を750-760nmで励起すると励起効率が良いことが分かった。この蛍光色素のモデル液を760nmで励起して、Ca濃度に対応する蛍光強度を測定したところ、1光子励起で報告されている解離定数とほぼ等しい値を得た。この色素のEmission spectrumは、1光子励起で得られたものと同等であった。
通常、Ratiometric Ca濃度測定に用いられるIndo-1を700nmの超短パルスレーザー光で2光子励起したところ、蛍光は得られたが、Ca濃度の変化に対応するような蛍光強度比の変化は得られなかった。
この色素のEmission Spectrumを測定したところ、高Ca濃度のSpectrumは蛍光強度が低く、1光子励起において長波長の励起光を用いたのと同等の効果であった。700nmは現実的に、この超短パルスレーザー装置の短波長限界なので、現時点でのIndo-1使用は不適切であると結論した。そこでRatiometric Ca濃度測定のために、Calcium Green-1とTexas RedのDextran結合物を用いた。Emission spectrumを測定したところ、この色素の蛍光強度比は、Ca濃度上昇に対応して変化した。
2) 超短パルスレーザー光を試料面に照射して、Caged Ca化合物(DM-nitrophen)を2光子励起により光解除した。この結果起こる局所Ca濃度上昇を、共焦点装置を用いてモニターした。このCaイメージングは、Fluo-3をアルゴンレーザーで通常の1光子励起することによって行った。Fluo-3は2光子励起効率が低いため、このような2光子励起でのCaged Ca化合物解除実験でCa濃度変化を(1光子励起法で)モニターする目的に適した色素であった。
Patch clamp法を用いて、カエル交感神経節細胞にも、DM-nitrophenとFluo-3を注入した。モデル液の実験と同様に局所でのCa濃度上昇が観察された。

研究成果

• [文献書誌] KUBA,K,& NAKAYAMA,S.: "Two-photon laser-scanning microscopy:Tests of objective lenses and Ca^<2+>." Neuroscience Research. 32. 281-294 (1998)
• [文献書誌] WATANABE,J.,NAKAYAMA,S.,ET AL.: "Regulation of intracellular free Mg^<2+> concentration in isolated rat hearts via β-adrenergic and muscarinic receptors." Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30. 2307-2318 (1998)
• [文献書誌] HUNAG,S.-M.,NAKAYAMA,S.,ET AL.: "Voltage sinsitivity of Slow wave frequency in isolated circular muscle strips from guinea pig gastric antrum." American Journal of Physiology. 276. G518-528 (1999)