| 研究概要 |
Protein Disulfide Isomerase(PDI)とそのファミリー蛋白質(ERp61,ERp72など)はER内での蛋白質のS-S結合形成に関与している酵素であるが、PDIについては分子シャペロンとして働くことを示唆する報告がある。本研究ではPDIファミリー蛋白質のうちERp72のシャペロン機能を解析することを目的に、ERp72のペプチド結合ドメインを同定することを試みた。マウスERp72のcDNAに変異を加えて、段階的にC末端側を削除したdeletion mutantcDNAsを作製し、histidine tagsを持った蛋白としてそれぞれのmutantsをE.coliで発現させ、精製した。これらについて、還元変性凝集したインスリン・ペプチドへの結合能を解析したところ、full sizeのwild rERp72は約10%がインスリン凝集ペプチドに結合し、ラット肝マイクロゾーム分画より精製したnative ERp72と同程度のペプチド結合能を示した。C末端側より59、80、115残基を欠失させたdelution mutant rERp72もwild rERp72と同程度のペプチド結合能を示した。一方、150残基を欠失させたdelution mutantは、予想に反してほぼ100%がインスリン凝集ペプチドに結合した。さらに欠失を266残基にまで拡大すると、ペプチド結合能は50%程度に減少した。より欠失を大きくしたdelution mutantはまだ作製されていないため、完全に結合性が失われてしまうdeletionがどの部位か決定されていないが、この結果は、2番目と3番目のthioredoxin domainsの間の領域にペプチド結合に関与するdomainが存在し、C末端側の領域がこれを抑制的に制御していると解釈できる。
しかしながら、deletionによる疎水性領域の露出などの影響も考慮する必要があるため、蛋白分解酵素を用いた限定分解によるdomain解析を行っている。
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