遺伝子導入ハエを用いたDREFの機能

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10173235
• 研究機関: 愛知県がんセンター
• 研究代表者: 広瀬 富美子 愛知県がんセンター, 生物学部, 主任研究員 (60208882)
• 研究分担者: 井上 善博 愛知県がんセンター, 生物学部, 主任研究員 (90201938) ; 山口 政光 愛知県がんセンター, 生物学部, 室長 (00182460)
• キーワード: 転写因子 / ショウジョウバエ / DNA複製 / 遺伝子導入動物

研究概要

個体を用いて、DREFの機能解析をするために、DREFを唾腺および複眼原基で異所的に発現する遺伝子導入ハエを樹立した。DREF遺伝子の機能発現を調節する因子の遺伝子を同定する目的で、以下の3つのスクリーニングを行い、遺伝子の単離、同定を進めた。(1)DREFタンパク質を複眼原基で発現させると、異所的なDNA複製とアポトーシスが誘導される結果として秩序だった複眼の形態形成は乱されて、rough eye phenotypeを示す遺伝子導入ハエとP-エレメントの挿入変異を持つハエを交配し、特定の遺伝子のコピー数を半減することで、このrough eye phenotypeを増強または、抑制する遺伝子を遺伝学的にスクリーニングした。第3染色体のP-エレメントの挿入変異体を約3000系統スクリーニングした結果、rough eye phenotypeを増強するもの9系統と抑制するもの8系統を得た。これらのDREFと遺伝学的に相互作用する遺伝子はP-エレメントレスキュー法により行い、rough eye phenotypeを増強する系統の1つが転写因子stonewallの変異体であることがわかった。rough eye phenotypeを抑制する系統の中には、DNA複製因子RF-Cと転写因子E2Fの変異体があり、RF-C遺伝子、E2F遺伝子ともに転写調節領域にDREFの結合配列が存在していた。E2F遺伝子の場合には、そのプロモーター活性が、DREFタンパク質を高発現するとE2F遺伝子のプロモーター内に存在するDRE配列に依存して上昇することから、E2F遺伝子の発現はDREFによる正の制御を受けていることを証明した。(2)酵母のtwo hybrid screeningによるDREF結合因子のスクリーニングにより、MLF(myeloid leukemia factor)のショウジョウバエホモログとdTAF230を単離した。(3)酵母のone hybrid screening法により、DRE配列に結合するDREF以外の因子をスクリーニングした結果、転写因子Cutが同定できた。さらに、抗DREF抗体を用いた免疫沈降実験によりTAF230やCBPがDREFと結合することも明らかにした。

研究成果

• [文献書誌] Takahashi,Y.: "Identification of three conserved regions in the DREF transcription factors from Drosophila melanogaster and Drosophila virilis" Nucleic Acids Res.27. 510-516 (1999)
• [文献書誌] Sawado,T.: "The DNA replication-related element(DRE)/DRE-binding factor system is a transcriptional regulator of the Drosophila E2F gen-C" J.Biol.Chem.273. 26042-26051 (1998)
• [文献書誌] Kuge,M.: "Use of a fusion protein to obtain crystals suitable for X-ray analysis:Crystalization of a GST-fused protein containing the DNA-binding domain of DNA-replication-related・・・" Protein Science. 6. 1783-1786 (1997)
• [文献書誌] Ohno,K.: "cDNA cloning and expression during development of Drosophila melanogaster MCM3,MCM6 and MCM7" Gene. 217. 177-186 (1997)
• [文献書誌] Yamaguchi,M.: "Distinct roles of E2F recognition sites as positive or negative elements in regulation of the DNA polymerase α 180KDa catalytic subunit gene promoter・・・・" Nucleic Acids Res.25. 3847-3854 (1997)
• [文献書誌] Hayashi,Y.: "Identification of CFDD(common regulatory factor for DNA replication and DREF gene)and role of its binding site in regulation of the proliferating cell ・・・・・" J.Biol.Chem.272. 22848-22858 (1997)