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1. 3本のRNA鎖からなるHDVリボザイム(Rz1)のRNaseによる限定加水分解
Rz1は、35-mer(1)および16-mer(2)よりなる酵素成分と8-mer(3)よりなる基質成分から構成されている。オリゴマー3の切断部位のシチジン残基の2'-OHをメチル化した切断されない基質アナローグを含むRz1複合体を10mMマグネシウムイオン存在下、水素結合していない一本鎖の部分に特異的なRNase T1およびRNase MB、2重鎖形成部分に特異的なRNaseVで限定加水分解を行い、ゲル電気泳動で分析した。その結果、Rz1はBeenらの提唱したブソイドノット型の2次構造をとり、ステムIIとステムIV間の接合部とステムIIIのループ部の2次構造が示唆された。
2. NMRによる3本のRNA鎖からのRz1複合体形成の確認
イミノプロトン領域のNMRスペクトルを測定し、複合体形成を確認した。オリゴマー1と2は、それぞれ単独で2次構造を形成していたが、混ぜ合わせると新しいシグナルが現れた。この酵素複合体にオリゴマー3を滴定して行くと、更にスペクトル変化が起こり、新しいシグナルも出現した。このRz1複合体の2次元NOESYスペクトルを測定すると、出現した2本のシグナルの間に強いNOEが見られ、基質と酵素の結合により生成が期待されるG:U塩基対に由来するものと思われた。
3. NMRによるRz1複合体とマグネシウムイオンの結合の確認
切断されない基質アナローグを含むRz1複合体にマグネシウムイオンを加えると、特定のシグナルに顕著な強度の変化と小さなケミカルシフトの変化が観察された。これにより、マグネシウムイオンの結合により全体の構造はあまり変化せず、居所的な変化にとどまる事が判った。
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