蛋白質間相互作用解析のための新しい解析法の開発

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10179101
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 阿久津 秀雄 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (60029965)
• 研究分担者: 片岡 幹雄 奈良先端科学技術大学院大学, 教授 (30150254) ; 佐藤 衛 横浜市立大学, 総合理学研究科, 教授 (60170784) ; 甲斐荘 正恒 東京都立大学, 大学院・理学研究科, 教授 (20137029)
• キーワード: 蛋白質間相互作用 / タンパク質区分標識法 / NMR / 溶液構造決定法 / マジック角試料回転 / 固体NMR / Ab initio X線結晶構造解析法 / チオエステル法

研究概要

A03班はタンパク質間相互作用解析のための新しい方法論の開発で大きな成果をあげた。
1)大きなタンパク質の構造解析をめざして、インテインを用いたタンパク質の区分標識法を開発した。これは2本と3本の断片に分けて行うことが可能であることが示された。構造既知のRNA polymerase α subunit C-domain、Maltose binding protein、ATP合成酵素βサブユニットに適用して成功した。特に、ATP合成酵素βサブユニットのように50kDa以上のタンパク質に対して有効であることを世界で初めて示した意義は大きい。さらに、スペクトルを簡単化する方法として、ほぼ全てのアミノ酸について必要最小限のプロトン以外を重水素化したアミノ酸の合成法を確立し、それらを用いて無細胞的にタンパク質合成する方法を確立した。これはわが国独自の独創的方法である。2)溶液NMRやX線結晶構造解析で研究することが困難な情報伝達タンパク質の構造と相互作用を明らかにすることを目的として、マジック角試料回転(MAS)下での固体多次元NMR法の開発を進めた。可能な限り多くの情報を得るために安定同位体均一標識試料を用いることを目標とした。情報変換で重要なGタンパク質を活性化する機能があるマストパランXを主な対象として、シグナルの配列帰属法のためのさまざまなパルス系列を開発し、タンパク質のシグナル配列帰属法を確立した。コンスタントタイム回転共鳴による距離決定法を開発して、これをマストパランXと脂質の相互作用の解析に適用した。3)非結晶学的対称性を利用したAb initio法に基づくウイルスのX線結晶構造解析法の開発を行った。この方法を用いて直径70nm、質量70000kDaのイネ萎縮病ウィルスの構造を3.5Aの分解能で決定した。このなかで、同じタンパク質サブユニットが異なる構造と相互作用をとりうることが示された。これは巨大タンパク質複合体を解析する上でのブレークスルーとなる重要な成果である。4)タンパク質間相互作用解析に必要な試料のために、チオエステルによるシステイン含有タンパク質の合成、リン酸化ポリペプチド化学合成、発現タンパク質をC末端セグメントとして用いる長鎖ペプチド合成等の合成法を開発し、本特定領域研究全体の研究者にさまざまな試料を提供した。また、膜貫通ドメインを2箇所有するATP合成酵素サブユニットcの合成と精製に成功した。

研究成果

• [文献書誌] K.Tozawa 外5名: "Functions and ATP-binding responses of the twelve histidine residues in the TF_1-ATPase β subunit"J. Biochem.. 130. 527-533 (2001)
• [文献書誌] S.Hanaoka 外6名: "NMR Structure of the hRap1 Myb Motif Reveals a Canonical Three-helix Bundle Lacking the Positive Surface Change Typical of Myb DNA-Binding Domains"J. Mol. Biol.. 312. 167-175 (2001)
• [文献書誌] R.Riek 外4名: "[^<13>C,^<13>C] -and [^<13>C,^1H] -TROSY in a Triple Resonance Experiment for Ribose -base Intrabase Correlations in Nuclei Acids"J. Am. Chem. Soc.. 123. 658-664 (2001)
• [文献書誌] S.Yuzawa 外8名: "Solution structure of Grb2 reveals extensive flexibility necessary for target recognition"J. Mol. Biol.. 306. 527-537 (2001)
• [文献書誌] K.Ida 外8名: "The 1,55 A resolution structure of Nicotiana alata SF11-RNase associated with gametophytic self-incompatibility"J. Mol. Biol.. 314. 103-112 (2001)
• [文献書誌] H.Tanaka 外6名: "X-ray Crystalline Structure of Pyrrolidine carboxyl peptidase from a Hyperthermophile, Pynococcus furiosus, and Its Cys-Free Mutant"J. Biochem.. 130. 107-118 (2001)