エンドサイトーシス初期過程におけるダイナミンGTPaseの機能の解明

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10215202
• 研究機関: 山梨医科大学
• 研究代表者: 馬場 健 山梨医科大学, 医学部, 助教授 (90208710)
• 研究分担者: 竹居 孝二 岡山大学, 医学部, 教授 (40322226) ; 植田 秀穂 山梨医科大学, 医学部, 助手 (10242629) ; 藤井 靖久 山梨医科大学, 医学部, 助手 (60126703)
• キーワード: エンドサイトーシス / ダイナミン / クラスリン / アデノウイルスベクター / リポソーア / PIP2

研究概要

本研究の目的はダイナミンGTPaseの機能と局在を、細胞内蛋白質および細胞膜脂質から解明していくことである。本年度に得られた成果は以下の通りである。A.in vivo系でのエンドサイトーシスの解析。(1)野生型(Wt)および変異ダイナミン(K44A、S45N、T65F)をアデノウイルスベクターを用いて、tTAHeLa細胞に強制発現させ、16時間後のエンドサイトーシス能と導入遺伝子発現率を蛍光抗体法およびウエスタンブロッティングで確認した。その結果、Wt,K44A,S45N,T65Fのいずれもがほぼ100%の細胞で発現されており、変異ダイナミン遺伝子導入細胞では著しいエンドサイトーシスの阻害が認められた。電顕的観察により、変異ダイナミン導入細胞ではクラスリン被覆小胞形成に至らない多様な被覆ピットが形成されていたが、T65F変異ではピット頚部が長く、一部ではリング状の構造が取り巻いていた。(2)GFP標識クラスリンを導入したK562細胞をデジタルタイムラプス顕微鏡で観察したところ、細胞表面でクラスリンは点状の蛍光として頻繁に取り込まれ、再出現する像がとらえられた。(3)PEG-Cholを用いて細胞膜を修飾すると、濃度依存性にクラスリン被覆ピットが開口していくが、ダイナミンの局在には、影響しないことが明らかとなった。B.in vitro系でのエンドサイトーシスの検討。種々の組成のリポソームをATPおよびGTPの存在下で脳細胞質とin vitroで反応させ、形成される小胞の性状をネガティブ染色で観察し、形成される小胞の直径と形成量を動的光散乱法により検討した。その結果、コレステロールは小胞形成量には影響しなかったが、小胞を大型化した。一方、PIP2の含有量を増加させると小胞形成量は増加したが、小胞の大きさには変化がなかった。また、反応後のリポソームではPIP2量が減少していた。

研究成果

• [文献書誌] Xue M,Baba T,Terada N,Kato Y,Fujii Y,Ohno S: "Morphological study of erythrocyte shapes in red pulp of mouse spleens revealed by an in vivo cryotechnique"Histol Histopathol. 16. 123-129 (2001)
• [文献書誌] Ueda H,Baba T,Toriumi H,Ohno S: "Anionic sites in articular cartilage revealed by polyethyleneimine staining"Micron. 32. 439-446 (2001)
• [文献書誌] Takeda M,Takayama I,Terada N,Baba T,Ward SM,Ohno S,Fujino MA: "Immuno-electron microscopic study of kit-expressing cells in the jejunum of wildtype and Ws/Ws rats"Cell Tiss Res. (in press). (2001)
• [文献書誌] Lamaze C,Dujeancourt A,Baba T,Lo CG,Benmerah A,Dautry-Varsat A: "Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway"Molecular Cell. (in press). (2001)