液胞形成における小胞輸送の分子機構

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10215203
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 和田 洋 大阪大学, 産業科学研究所, 助教授 (50212329)
• 研究分担者: 孫 戈虹 大阪大学, 産業科学研究所, 助手 (00314427)
• キーワード: 小胞輸送 / オルガネラ / エンドソーム / リソソーム / プロトン

研究概要

酵母で発現可能なマウスcDNAライブラリーを新規に構築し,これを酵母変異株に導入して液胞形成欠損表現型の回復を指標にマウスsyntaxin-7を単離し,この分子が後期エンドソーム・リソソームに局在することを見いだした.Syntaxin-7の膜貫通ドメインを欠失したsyn7ΔTMD分子を培養細胞で強制発現させると巨大なmultivesicular body(MV)が蓄積する.MVは後期エンドソームマーカー分子Lamp-2で染色される.これらの結果は後期エンドソームの膜動態に関与するt-SNARE分子がsyntaxin-7であることを示している.
酵母のVam2p,Vam6pのマウスホモログを同定し,GFPとの融合タンパク質が後期エンドソームに局在することを明らかにした.この細胞内局在はこれらの分子が後期エンドソーム・リソソームの膜動態を担うことを強く示唆している.
液胞・リソソーム・エンドソームは内腔のpHが低い,酸性コンパートメントであり,酸性化には液胞型プロトン輸送性ATPase(V-ATPase)が機能する.V-ATPase膜内在性サブユニットを欠損させた遺伝子破壊マウスは胚発生の初期(受精後4.5-5.5日)に致死となることを示した.マウス胚のin vitro培養系を確立し,3.5-4.5日胚では顕著に酸性オルガネラが発達することを見いだした.さらに,V-ATPaseの100-kDaサブユニットの異なるisoformが破骨細胞でオルガネラ局在と形質膜局在の2つの特異的局在を示すことを明らかにした.この2つのisoformは形質膜と細胞内膜との選択的輸送のメカニズムを明らかにするcis配列,さらにはtrans因子を探索する際の鍵となる.

研究成果

• [文献書誌] Nakamura N. 他: "Syntaxin 7 mediates endocyteic trafficking to late endosomes"Journal of Biological Chemistry. 275. 6523-6529 (2000)
• [文献書誌] Le NP. 他: "Escherichia coli ATP synthase α subunit Arg-376 : the catalytic site arginine does not participate in he hydrolysis/synthesis reaction but is required for promotion to the steady state"Biochemistry. 39. 2778-2783 (2000)
• [文献書誌] Hirata T. 他: "Regulation and reversibility of vacuolar H^+-ATPase"Journal of Biological Chemistry. 275. 386-389 (2000)
• [文献書誌] Petalcorin MI 他: "Disruption of clh-1, a chloride channel gene, results in a wider body of Caenorhabditis elegans"Journal of Molecular Biology. 294. 347-355 (1999)
• [文献書誌] Futai M. 他: "Luminal acidification of diverse organelles by V-ATPase in animal cells"Journal of Experimental Biology. 203. 107-116 (2000)
• [文献書誌] Sambongi Y. 他: "Mechanical rotation of the c subunit oligomer in ATP synthase (F_0F_1) : direct observation"Science. 286. 753-757 (1999)
• [文献書誌] Omote H. 他: "The γ subunit rotation and torque generation in F_1-ATPase from wild-type or uncoupled mutant Escherichia coli"Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 96. 7780-7784 (1999)
• [文献書誌] Toyomura T. 他: "Three subunit a isoforms of mouse vacuolar H^+-ATPase : preferential expression of the a3 isoform during osteoclast differentiation"Journal of Biological Chemistry. 275 (印刷中). (2000)
• [文献書誌] Sanbongi Y. 他: "Sensing of cadmium and copper ions by externally exposed ADL, ASE, and ASH neurons elicits avoidanceresponse in Caenorhabditis elegans"NeuroReport. 10. 753-757 (1999)