生物活性物質の生理適合化学選択性を評価する分子センシング

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10304061
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 梅澤 喜夫 東京大学, 大学院・理学系研究科, 教授 (80011724)
• 研究分担者: BUHLMANN Philippe 東京大学, 大学院・理学系研究科, 助手 (20262149) ; 遠田 浩司 東京大学, 大学院・理学系研究科, 助手 (60212065) ; 菅原 正雄 日本大学, 文理学部, 教授 (50002176)
• キーワード: 生理活性物質 / 蛍光プローブ / 選択性 / 表面プラズモン共鳴 / 蛍光共鳴エネルギー移動 / インシュリン / カルモジュリン / 生理適合性

研究概要

1.インシュリン(Ins)情報伝達過程のチロシンリン酸化を可視化する蛍光プローブ分子を開発した.IRS-1のチロシンリン酸化部位を含む合成リン酸化ペプチドpY939とP13-kinaseのSH2N蛋白質をそれぞれテトラメチルローダミン(T)とフルオレセイン(F)で蛍光標識した(T-pY939,F-SH2N).F-SH2N―T-pY939錯体形成によるドナーFとアクセプターTの相互近接により,蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)が誘起された.このFRETはIns濃度依存的に解消されることから,FRETpairはIns情報伝達のリン酸化を可視化する蛍光プローブ分子となることが分かった.(Anal.Chem.71,3948-3954(1999))
2.表面プラズモン共鳴(SPR)法によるIns情報伝達過程のアゴニスト選択性評価法を開発した.Insとリセプター及びその基質となるY939を一定時間反応させ,SH2Nを添加した溶液を,pY939を固定化した金薄膜表面上にフローセルを用いて一定時間流したところ,Ins濃度に依存したSPR応答を得た.Ins様作用を持つIGF-I,IGF-IIはIRを介した情報伝達系を活性化するが,4価バナジウムイオン,チアゾリジン系糖尿病治療薬はSPR応答変化を示さないことからPI3-kinase以降の情報伝達系に作用していることが分かった.(Anal.Chem.72,6-11(2000))
3.SPR法によるカルモジュリン(CaM)とその標的ペプチドM13との相互作用に基づく生理適合的金属イオン選択性を評価した.33種類の金属イオン選択性評価を行い,Sr^<2+>,Ba^<2+>,Cd^<2+>,Pb^<2+>,及びランタノイドイオンがCa^<2+>と同様にカルシウム情報伝達系を活性化することを示した.(Biochem.Biophys.Acta,1434,211-220(1999))

研究成果

• [文献書誌] T. Yoshida et al.: "An SPR-based Screening Method for Agonist Selectivity for Insulin Signaling Pathways Based on the Binding of Phosphotyrosine to its Specific Binding Protein"Anal. Chem.. 72. 6-11 (2000)
• [文献書誌] M. Sato et al.: "A Fluorscent Indicator for Tyrosine Phosphorylation-Based Insulin Signaling Pathways"Anal. Chem.. 71. 3948-3954 (1999)
• [文献書誌] T.Ozawa et al.: "Metal Ion Selectivity for Formation of the Calmodulin-Metal-Target Peptide Ternary Complex Studied by Surface plasmon Resnance Spectroscopy"Biochim. Biophys. Acta. 1434. 211-220 (1999)