高活性型ルビスコの開発を目指した二酸化炭素固定の分子機構解明

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10305065
• 研究種目: 基盤研究(A)
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 甲斐 泰 大阪大学, 大学院・工学研究科, 教授 (40029236)
• 研究分担者: 望月 衛子 大阪大学, 大学院・工学研究科, 教務職員 (10150335) ; 井上 豪 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助手 (20263204) ; 金久 展子 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助手 (20177538)
• キーワード: X線結晶構造解析 / 炭酸固定酵素 / ルビスコ / 迅速X線回析計 / 蛋白質複合体 / 蛋白質の結晶化

研究概要

まず、Galdieria partitaルビスコを抽出・精製し、高純度試料を得た。抽出・精製の方法はすでに確立しているが、さらに収率や純度の向上を図るための条件検索を行った。(担当、望月;緩衝液、ポリエチレングリコール、有機溶媒などの試薬類、精製用カラムなどのガラス器具類)。単結晶を得る条件はすでに得られているが、さらに条件の改良を行い、X線回折実験に適したものを得た。(担当、金久;結晶調製用のガラス器具、試薬類)
ルビスコの結晶はX線による損傷を容易に受けるので、精度の良い回折データを測定するためには、結晶の損傷が少ないうちに新しい結晶に次々と交換しなければならない。そのため、通常の方法でデータ測定する場合、一セットのデータを取り終わるまでに多くの結晶が必要となり、測定の効率やデータの精度に問題を生じることになる。また、ルビスコは大きなサブユニット8個と小さなサブユニット8個からなる蛋白質複合体であり、分子量約56万と非常に大きいため、その結晶格子は一般に大きくなる。特に、Galdieria partitaルビスコの結晶は格子定数が大きいので、当研究室が現在保有するイメージングプレート型X線回折装置ではX線検出器の面積が小さすぎ、原子レベルでの構造解析に必要な高分解能のデータを測定することができない。したがって、ルビスコのように大きな蛋白質複合体の構造解析は、現在のところ放射光実験施設を利用する以外には方法はないが、放射光利用には使用上の制約も多いので、何とか実験室内でそれに近い実験成果を上げることができないかが切実な問題となっている。最近、従来のものより高感度のイメイジングプレートを使用し、またフレーム毎に露光と読み出しの2つのイメージングプレートを交互に入れ替える従来の機構を改良して、ベルト状のイメージングプレートを用いた新しい2次元回折計が開発されたので、本科研費により導入し、Galdieria partitaルビスコのx線回折強度測定を行った。(担当、井上;迅速二次元X線回折計、X線フィラメント)

研究成果

• [文献書誌] Y.Sasakawa,et al.: "Spectroscopic characterization and kinetic studies of a novel plastocyanin from the green alga Ulva pertusa." Inorganica Chimica Acta,. 283. 184-192 (1998)
• [文献書誌] H.Matsuura,et al: "A novel mode of target recognition suggested by the 2.0 Å structure of holo S100B from bovine brain." Structure. 6. 233-241 (1998)
• [文献書誌] H.Hashimoto,et al.: "Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of archaeal O^6-methylguanine-DNA methyltransferase." Acta Cryst.D54. 1395-1396 (1998)
• [文献書誌] C.Li,et al.: "Structure of Azurin-1 from Denitrifying Bacterium Alcaligenes Xylosoxidans NCIMB 11015 at 2.45 Å Resolution" Acta Cryst.D54. 347-354 (1998)
• [文献書誌] T.Inoue,et al.: "Type 1 Cu Structure of Blue Nitrite Reductase from Alcaligenes xylosoxidans GIFU 1051 at 2.05 Å resolution : A Comparison between Blue and green Nitrite Reductases" J.Biochem.124. 876-879 (1998)
• [文献書誌] T.Inoue,et al.: "Crystallization and Preliminary X-ray Study of iso-2 Azurin from Methylotrophic Bacterium,Methylomonas J." Acta,Cryst.D55. 307-309 (1999)
• [文献書誌] N.Shibata,et al.: "Novel Insight into the Copper-Ligands Geometry in the Crystal Structure of Ulva pertusa Plastocyanin at 1.6 Å resolution" J.Biol.Chem.274. 4225-4230 (1999)
• [文献書誌] Y.Kai,et al.: "Three-dimensional structure of phosphoenolpyruvate carboxylase : A proposed novel mechanism for allosteric inhibition" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 96. 823-828 (1999)
• [文献書誌] H.Sugawara,et al.: "Crystal structures of wild-type and mutant plastocyanins from higher plant Silene" J.Biochem.(in press). (1999)
• [文献書誌] T.Kohzuma,et al.: "The structure and unusual pH-dependence of plastocyanin from the fem Dryopiens crassirhizoma : the protonation of an active-site histidine is hindered by π-π interactions." J.Biol.Chem.(in press). (1999)
• [文献書誌] T.Inoue,et al.: "Crystal structure determunations of oxidized and reduced plastocyanin from the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7942" Biochemistry. (in press). (1999)
• [文献書誌] T.Inoue,et al: "Crystallization and Preliminary X-ray analysis of plastocyanin from cyanobacterium Synecochoccus sp.PCC 7942." Acta.Cryst.,D. (in press). (1999)