高活性型ルビスコの開発を目指した二酸化炭素固定の分子機構解明

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10305065
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 甲斐 泰 大阪大学, 大学院・工学研究科, 教授 (40029236)
• 研究分担者: 望月 衛子 大阪大学, 大学院・工学研究科, 教務職員 (10150335) ; 井上 豪 大阪大学, 大学院・工学研究科, 講師 (20263204) ; 金久 展子 大阪大学, 大学院・工学研究科, 講師 (20177538)
• キーワード: X線結晶構造解析 / 炭酸固定酵素 / ルビスコ / 迅速X線回折計 / 蛋白質複合体 / 蛋白質の結晶化

研究概要

平成10年度の研究で、Galdieriaルビスコの3次元構造解析を完成した。そこで、今年度は、すでに構造解析の終了しているホウレンソウルビスコとGaldieriaルビスコについて、炭酸固定の分子機構を明らかにするための構造化学的研究を行った。
**構造解析されているルビスコは、酵素(E)にHCO3-(C)が作用して活性化されたEC複合体に、活性中心となるMg2+(M)が結合したECM複合体に、さらに基質が炭酸固定を受けて生成する中間体類似体(2-CABP)が結合したECM-(2-CABP)複合体の形を取っている。
今年度は、このECM-(2-CABP)複合体にさらに6-PGが結合したECM-(6-PG)-(2-CABP)複合体、及びECM-(2-CABP)複合体の金属活性中心をMg2+からMn2+に置き換えたEC-Mn2+-(2-CABP)複合体の結晶構造解析を行った。6-PGが結合することによって、高等植物にみられる炭酸固定活性のホールオーバー現象が消失する。また活性中心がMg2+からMn2+に置き換わることによって、炭酸固定活性が大幅に低下する。これらの分子機構を酵素の三次元構造に基づいて明らかにすることを目的とした研究を行った。また、Galdieriaルビスコは、これまで知られているルビスコの中では最も炭酸固定能の高いものであるため、その高分解能構造解析が必要である。そのために、ECM-(2-CABP)複合体の液体窒素温度での構造解析、ECM複合体や酵素そのもの(E)の構造解析も進めている。
現在までの実験で、ECM-(6-PG)-(2-CABP)複合体とEC-Mn2+-(2-CABP)複合体の結晶構造解析を行い構造精密化を進めているが、更に分解能を向上させるための努力を続けている。また、ECM複合体や酵素そのもの(E)の良好な単結晶の成長に成功し、X線回折実験を進めている。
酵素の抽出精製(緩衝液、ポリエチレングリコール、有機溶媒などの試薬類、精製用カラムなどのガラス器具類)は望月が、結晶化(結晶調製用のガラス器具類、試薬類)は金久が担当した。また、X線回折実験(迅速二次元X線回折装置、X線フィラメント)は井上が担当し、構造化学的議論(計算機媒体)は甲斐がとりまとめた。

研究成果

• [文献書誌] T. Inoue, et al.: "Crystallization and Preliminary X-ray Study of iso-2 Azurin from Methylotrophic Bacterium, Methylomonas J"Acta Cryst.,. D55,. 307-309 (1999)
• [文献書誌] N. Shibata, et al.: "Novel Insight into the Copper-Ligands Geometry in the Crystal Structure of Ulva pertusa Plastocyanin at 1.6 A Resolution"J. Biol. Chem.,. 274,. 4225-4230 (1999)
• [文献書誌] T. Inoue, et al.: "Crystallization and Preliminary X-ray Analysis of Plastocyanin from Cyanobacterium Synechococcus sp. PCC7942"Acta. Ciyst.,. D55,. 683-684 (1999)
• [文献書誌] T. Inoue, et al.: "Crystal Structure Determinations of Oxidized and Reduced Plastocyanin from the Cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7942"Biochemistry,. 38,. 6063-6069 (1999)
• [文献書誌] T. Kohzuma, et al.: "The Structure and Unusual pH-dependence of Plastocyanin from the Fern Dryopteris crassirhizoma : the Protonation of an Active-Site Hisutdine is Hindered by p-p interactions"J. Biol. Chem.,. 274,. 11817-11823 (1999)
• [文献書誌] Y. Kai, et al.: "Three-Dimensional Structure of Phosphoenolpyruvate Carboxylase : A Proposed Novel Mechanism fro Allosteric Inhibition"Proc. Natl. Acad. Sci. USA,. 96,. 823-828 (1999)
• [文献書誌] H. Sugawara, et al.: "Crystal Structure of Wild-type and Mutant Plastocyanins form Higher Plant Silene"J. Biochem.,. 125,. 899-903 (1999)
• [文献書誌] T. Inoue, et al.: "Crystal Structure Determination of Oxidized and Reduced Pseudoazurin from Achromobacter cycloclastes: Concerted Movement of Copper Site in Redox Forms with the Rearrangement of Hydrogen Bond at a Remote Histidine"J. Biol. Chem.,. 274,. 17845-17852 (1999)
• [文献書誌] T. Inouc, et al.: "Structure Comparison between Oxidized and Reduced Plastocyanin from a Fern, Dryopteris crassirhizoma"Biochemistry,. 38,. 13853-13861 (1999)