| 研究課題/領域番号 |
10306006
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 研究機関 | 京都工芸繊維大学 |
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研究代表者 |
松本 継男 京都工芸繊維大学, 繊維学部, 教授 (40107355)
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| 研究分担者 |
橋本 義文 京都工芸繊維大学, 繊維学部, 助教授 (60211471)
伴戸 久徳 北海道大学, 農学部, 助教授 (20189731)
前川 秀彰 国立感染症研究所, 放射能管理室, 省令室長(研究職) (60100096)
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| キーワード | 家蚕核多角体病ウイルス / 温度感受性変異株 / iel / レトロトランスポゾン / DNAワクチン / プロモーター / インターフェロン / 不全感染 |
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| 研究概要 |
平成10年度の役割分担にもとづき、以下の研究成果が達成された。
1) BmNPV温度感受性変異株の分離と一次構造の決定:
BmNPV温度感受性変異株ts-S2について、温度感受性を規定する変異とそれを含む遺伝子を明らかにした。変異遺伝子はp143と呼ばれるバキュロウイルスに共通して存在する推定DNAヘリカーゼ遺伝子であり、ヘリカーゼ遺伝子に一般に存在するモチーフV内で、バキュロウイルスの相同遺伝子で共通したアミノ酸残基、MetがValに変異していることが判明した。この変異は、当該ウイルスが非許容温度で増殖する能力を喪失させると推察された。
2) 粘膜上皮感染モデル:抗原遺伝子の発現による機能評価:
DNAワクチン創製へのバキュロウイルスの利用に関して、まずバキュロウイルスでの遺伝子発現及びその機能解析ができる系が必要である。そこですでに in vitroで発現及びその機能であるゲノムへの挿入が明らかにされているレトロトランスポゾンR2Bmをモデルとしてテスト用の系を確立することにした。R2Bmを核多角体病ウイルスAcNPVに導入し培養細胞でその発現を調べた。目的のタンパク質の大きさが120kdと大きく通常の方法では調製時に分解を受けている可能性がでてきたのでインヒビターの使用を検討する必要が生じた。ゲノムへの組み換えが生じた可能性のあるバンドを切りだし塩基配列を解析中である。以上の2点を確認することで系の確立が進むと考えている。
3) ウイルスプロモーターの改良/ミトコンドリアDNAの構造決定:
BmNPVのielプロモーターは宿主因子のみで高い発現活性を示すプロモーターである。このielプロモーターの構造を改変する事により、活性をおよそ30倍にまで上昇させることに成功した。そこで、この改変プロモーターを用いてヒト インターフェロン-α(INFα)を持続的に発現するBmN細胞を溝築したところバキュロウイルスベクターを用いた場合と匹敵するINFαを培養液中に回収する事が可能であった。
4) BmNPV温度感受性変異株のカイコにおける病毒性検定:
BmNPV ts-S1の病毒性をカイコ幼虫で評価するために、ウイルスの接種量および接種後のカイコ幼虫を非許容温度での飼育期間を変えてカイコ幼虫の成長パターンや死亡率を調査した。その結果、ウイルス接種後のカイコ幼虫の非許容温度での飼育期間が長いほど、また、ウイルス接種量が少ないほど、カイコの感染離脱が生じやすいことが判明した。また、感染離脱(不全感染)が認められるウイルス量のうち特定のウイルス量を接種したカイコ幼虫を許容温度で飼育すると、100%の致死率が得られる場合がある。この事実は、非許容温度飼育によりウイルス感染が完全に阻止されたことを示している。
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