異物排出輸送系の分子基盤と生理的機能

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10308029
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 山口 明人 大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (60114336)
• 研究分担者: 名田 茂之 大阪大学, 産業科学研究所, 助手 (50291448) ; 村上 聡 大阪大学, 産業科学研究所, 助手 (30300966)
• キーワード: 異物排出蛋白 / 薬剤耐性 / 部位特異変異導入 / 排出 / ポストゲノム

研究概要

(1)テトラサイクリン排出タンパク構造機能解析では、タンパク質を構成する全400アミノ酸残基すべてを一つずつCysに置換する完全Cys走査変異体セットを構築し、おのおのの残基の役割、所在場所(膜の内外表面または二重層内)などを正確に決定したマップを分子全体に渡って作成できた。その結果、テトラサイクリン排出蛋白は内側6本、外側6本のへリックスが環状に束ねられ、中央に水で満たされたチャネルがあること、チャネルの中央部にはゲートが存在することなどが明らかにされた。さらに、Cys二重変異体を多数構築し、そのS-S架橋の有無を検討することにより、おのおのの膜貫通へリックスの相対配置を決定することができるようになりなり、分子生物学的に立体構造モデルを構築する道が開けてきた。
(2)動物細胞異物排出タンパクについては、MRPの薬剤排出測定系を確立し、保存性塩基性残基に部位特異変異導入を行い、膜貫通領域にあって、有機アニオン性基質の輸送に関与するアルギニン残基、ならびに阻害剤シクロスポリンA結合に関与する残基を同定した。
(3)膜輸送タンパク質としてははじめて、膜貫通内在性輸送蛋白の結晶化に成功し、現在Spring8において回折実験を行っている。これは、膜輸送蛋白では初めての立体構造決定であるばかりでなく、異物排出タンパクによる異物認識の分子機構が仮説としてではなくはじめて立体構造に基づいて明らかにすることができる。異物排出タンパクを克服する薬剤のドラッグデザインの基礎としても大いに期待している。
(4)血小板から脂質メディエータースフィンゴシン1リン酸分泌タンパクと推定される全く新しいABC輸送体遺伝子の全長をcDNAクローニングし、発現させることに成功した。

研究成果

• [文献書誌] Kimura-Someya,T.,Iwaki,S.,and Yamaguchi.A: "Site-directed Chemical Modification of Cysteine-scanning Mutants as to Transmembrane Segment II and Its Flanking Regions of the Tn10-encoded Metal-Tetracycline/H^+ Antiporter Reveales a Transmembrane Water-filled Channel."J.Biol.Chem.. 273. 32806-32811 (1998)
• [文献書誌] Kawabe,T.,and Yamaguchi,A.: "Transmembrane Remote Conformational Suppression of the Gly332 Mutation of the Tn10-encoded Metal-Tetracycline/H^+ Antiporter."FEBS Lett.. 457. 169-173 (1999)
• [文献書誌] Konishi,S.,Iwaki,S.,Kimura-Someya,T.,and Yamaguchi,A.: "Cysteine-scanning Mutagenesis around Transmembrane Segment VI of Tn10-encoded Metal-Tetracycline/H^+ Antiporter."FEBS Lett.. 461. 315-318 (1999)
• [文献書誌] Someya,Y.,Kimura-Someya,T.,and Yamaguchi,A.: "Role of the Charge Interaction between Arg70 and Asp120 in the Tn10-encoded Metal-Tetracycline/H^+ Antiporter of Escherichia coli."J.Biol.Chem.. 275. 210-214 (2000)
• [文献書誌] Kubo,Y.,Konishi,S.,Kawabe,T.,Nada,S.,and Yamaguchi,A.: "Proximity of Periplasmic Loops in the Metal-Tetracycline/H^+ Antiporter of Escherichia coli Observed on Site-directd Chemical Cross-linking."J.Biol.Chem. 275. 5270-5274 (2000)
• [文献書誌] Kimura-Someya,T.,Iwaki,S.,Konishi,S.,Tamura,N.,Kubo,Y.and Yamaguchi,A.: "Cysteine-scanning Mutagenesis around Transmembrane Segemnts 1 and 11 and Their Flanking Loop Regions of Tn10-encoded Metal-Tetracycline/H^+ Antiporter."J.Biol.Chem. 275. 18692-18697 (2000)
• [文献書誌] Iwaki,S.,Tamura,N.,Kimura-Someya,T.,Nada,S.,and Yamaguchi,A.: "Cysteine-scanning Mutagenesis of Transmembrane Segments 4 and 5 of the Tn10-encoded Metal-Tetracycline/H^+ Antiporter Reveals a Permeability Barrier in the Middle of a Transmembrane Water-filled Channel."J.Biol.Chem. 275. 22704-22712 (2000)
• [文献書誌] Kawabe,T.,Fujihira,E.,and Yamaguchi,A.: "Molecular Construction of a Multidrug Exporter System, AcrAB : Molecular Interaction between AcrA and AcrB, and Cleavage of the N-Terminal Signal Sequence of AcrA"J.Biochem.. 128. 195-200 (2000)
• [文献書誌] Ryu,S.,Kawabe,T.,Nada,S.,and Yamaguchi,A.: "Identification of Basic Residues Involved in Drug Export Function of Human Multidrug Resistance Aassociated Protein 2."J.Biol.Chem. 275. 39617-39624 (2000)
• [文献書誌] 山口明人,西野邦彦: "薬剤排出タンパク質とゲノム創薬への応用"バイオサイエンスとバイオインダストリー. 58. 11-16 (2000)
• [文献書誌] Nada,S.,Murakami,S.,Okamoto,S.,Kubo,Y.,and Yamaguchi,A.: "Monoclonal Antibody That Binds to the Central Loop of the Tn10-Encoded Metal-Tetracycline/H^+ Antiporter of Escherichia coli."J.Biochem.. 129. 87-91 (2001)
• [文献書誌] Nishino,K.and Yamaguchi,A.: "Overexpression of the Response Regulator evgA of the Two-Component Signal Transduction System Modulates Multidrug Resistance Conferred by Multidrug Resistance Transporters."J.Bacteriol.. 183. 1455-1458 (2001)
• [文献書誌] Tamura,N.,Konishi,S.,Iwaki,S.,Kimura-Someya,T.,Nada,S.,and Yamaguchi,A.: "Complete Cysteine-Scanning Mutagenesis and Site-Directed Chemical Modification of the Tn10-Encoded Metal-Tetracycline/H^+ Antiporter."J.Biol.Chem. 276(in press). (2001)