超分子システム内での1分子機能・分子間協調の顕微画像化と解析

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10308030
• 研究機関: 早稲田大学
• 研究代表者: 石渡 信一 早稲田大学, 理工学部, 教授 (10130866)
• 研究分担者: 藤田 英明 早稲田大学, 理工学部, 助手 (50318804) ; 船津 高志 早稲田大学, 理工学部, 助教授 (00190124)
• キーワード: 超分子システム / 1分子機能・分子間協調 / 顕微画像化・顕微解析 / アクチン・ミオシン間結合力 / キネシン・微小管結合力 / SPOC / 心筋収縮系 / シャペロニン

研究概要

分子モーター系の1分子計測:昨年度に引き続き、レーザー光ピンセット法を用いてアクチン・ミオシン、微小管・キネシンの滑り力、結合破断力(それらの温度依存性)、それに結合寿命に対する負荷依存性、破断力分布に対する負荷上昇速度依存性などを詳細に調べた。その結果、破断力分布は2つのピークをもち、しかも単頭ミオシンの破断力分布は小さい方のピーク(約7pN)に一致することから、単頭結合と双頭結合の間に平衡関係が存在することが裏付けられた。微小管・キネシンの場合には、硬直結合(ATP非存在下での結合)ではその平衡は単頭結合側に傾いており、AMP-PNP存在下では双頭結合側に傾いていた。キネシン分子の弾性率が1分子計測され、単頭結合では約0.4pN/nm、双頭結合では約0.8pN/nmと見積もられた。また、単頭結合から双頭結合への変換速度が0.3/sと見積もられた。これらの結果、キネシン分子モーターの運動機構の一端が明らかになった。心筋SPOC(自励収縮振動):Rhodamine-phalloidinラベルしたグリセリン処理心筋線維束を用いて、ADP-SPOC溶液中で筋節長振動周期を計測した。その結果、ウシでは20.8±1.4s、ブタでは16.7±2.6s、ウサギでは7.9±2.4s(それぞれ平均値±SD、n=5)となり、その心筋の由来する動物種の心拍数と強い相関を示した。このことは、ペースメーカー細胞による制御に加えて、心筋収縮系自体が(SPOC)自励振動系をなし、心臓が血液を効率よく送り出すためのポンプとして最適に機能するように構成されていることを示唆している。シャペロニン:GroEL-GroESの結合・解離サイクルと、シャペロニンによるGFPの折りたたみ過程を1分子蛍光イメージング法で可視化した結果、新たなcisATP複合体を発見した。GroELは2つの中間状態を利用して、効率よくタンパク質を折りたたむことが明らかになった。

研究成果

• [文献書誌] Fukuda,N. & Ishiwata,S.: "Effects of pH on spontaneous tension oscillation in skinned bovine cardiac muscle."Pfliigers Arch.-Enr.J.Physiol.. 438. 125-132 (1999)
• [文献書誌] Kato.H.et al.: "Imaging of thermal activation of actomyosin motors"Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 96. 9602-9606 (1999)
• [文献書誌] Fujita,H. & Ishiwata,S.: "Tropomyosin modnlates pH dependence of isometric tension."Biophys.J.. 77. 1540-1546 (1999)
• [文献書誌] Fukuda,N.et al.: "Effeets of MgADP on lenpth dependence of tension generation in skinned rat cardiac muscle."Circ.Res.. 86. e1-e6 (2000)
• [文献書誌] Harada,Y.et al.: "Single molecule imaging of RNA polymerase-DNA intoractions in real time."Biophys.J.. 76. 709-715 (1999)
• [文献書誌] Ishii,Y.et al.: "Fluorescenu resonance energy framsfer Eedween single Jluorophores wttached to a coiled-coil protein in agueous solution."Chemical Physics. 247. 163-173 (1999)