| 研究課題/領域番号 |
10450310
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
卜部 格 大阪大学, 大学院・工学研究科, 教授 (60029246)
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| 研究分担者 |
島 康文 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助手 (50187423)
四方 哲也 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (00222399)
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| キーワード | ペルオキシダーゼ / カタラーゼ / ランダム変異 / 反応特異性 |
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| 研究概要 |
Bacillus stearothermophilus由来のペルオキシダーゼは、ペルオキシダーゼ以外に強いカタラーゼ活性を有している。本酵素の高い耐熱性を維持しつつ、カタラーゼ活性を欠失させ、さらにペルオキシダーゼ活性を上昇させるという、3つの相異なる要求を満たす難易度の高い改良を行うために、昨年度作製した野生型酵素にランダム突然変異を導入して得られた第一次変異型酵素集団の中から、カタラーゼ活性が減少し、ペルオキシダーゼ活性が上昇し、かつ耐熱性の低下が少ない変異型酵素D130Nを取得した。得られた変異型酵素の遺伝子に、昨年度と同様の方法でランダム突然変異を導入し、第二次変異型酵素集団を作製した。得られた第二次変異型酵素集団内の変異型酵素について、そのペルオキシダーゼ活性、カタラーゼ活性、耐熱性を測定した。これらのデータをもとに、反応特異性がよりペルオキシダーゼ側に移行した変異型酵素を選抜した。この2段階のランダム点突然変異により、野生型酵素が98%カタラーゼでペルオキシダーゼ性は2%という反応特異性であったのに対し、第1段階のD130Nは20%のペルオキシダーゼ性、第2段階で得られた変異型酵素は58%のペルオキシダーゼ性と、反応特異性がペルオキシダーゼ側に変化した。第2段階で得られた変異型酵素遺伝子の塩基配列を決定したところ、108番目と222番目のイソロイシンがスレオニンに変異していると推定できたので、I108T/D130N/I222Tと命名した。
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