有用脂質生産を目指した糸状菌類の分子育種

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10460040
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 清水 昌 京都大学, 大学院・農学研究科, 教授 (70093250)
• 研究分担者: 小川 順 京都大学, 大学院・農学研究科, 助手 (70281102) ; 片岡 道彦 京都大学, 大学院・農学研究科, 助教授 (90252494) ; 小林 達彦 筑波大学, 応用生物化学系, 教授 (70221976)
• キーワード: 高度不飽和脂肪酸 / アラキドン酸 / γ-リノレン酸 / シトクロームb5 / 不飽和化酵素 / Mortierella alpina

研究概要

アラキドン酸生産性糸状菌Mortierella alpina 1S-4の脂肪酸不飽和化に関与するミクロソーム電子伝達系の構成要素であるcytochrome b_5とNADH-cytochrome b_5 reductaseのcDNAおよびゲノム遺伝子のクローニングに成功した。また、本cDNAを大腸菌および麹菌で発現させ精製し、その諸性質を明らかにした。さらに、ステアリン酸をオレイン酸へ不飽和化するΔ9-desaturaseのcDNAおよびゲノム遺伝子、オレイン酸をリノール酸に不飽和化するΔ12-desaturaseおよびリノール酸をγ-リノレン酸に不飽和化するΔ6-desaturaseのcDNAのクローニングに成功した。本Δ9-desaturaseをコードするゲノム遺伝子には一つのイントロンが存在し、ChambonらのGT-AG ruleに従わないGC-AG splicing junction sequenceを持つことを糸状菌で初めて発見した。また、それぞれのcDNAの麹菌での発現に成功し、菌体の脂肪酸組成を改変させ、それぞれの菌体中にオレイン酸、リノール酸、γ-リノレン酸を蓄積させることに成功した。以上、油脂蓄積性の糸状菌から初めて、一つのまとまった脂肪酸不飽和化反応系を分子レベルで解明した。
また、Mortierella alpina 1S-4の各種PUFA生合成変異株の取得を試みた結果、Δ6-desaturaseの活性が低下した変異株ST66株を取得した。本変異株においてはリノール酸が蓄積するとともに、リノール酸がΔ6位不飽和化反応を受けずに鎖長延長され、ついでΔ5-desaturaseにより不飽和化された20:3Δ5が蓄積した。以上、化学変異の誘導により、希少不飽和脂肪酸を生産する糸状菌の育種に成功した。

研究成果

• [文献書誌] 藤川茂昭,東山堅一,清水昌: "糸状菌によるアラキドン酸含有油脂の発酵生産"バイオサイエンスとインダストリー. 57・2. 818-821 (1999)
• [文献書誌] E.Sakuradani et al.: "△6-Fatty acid desaturase from an arachiolonic acid-producing Mortierella fungus, gene cloning and its heterologous expression in a fungus, Aspergillus"Appl. Environ. Microbiol.. 65・10. 4399-4403 (1999)
• [文献書誌] E.Sakuradani et al.: "Identification of an NADH-Cytohrome b5 Reductase Gene from an Arachidanic Acid-Producing Fungus, Mortierella alpina IS-4, by Sequencing of the Encoding cDNA and Heterologous Expression in a Fungus, Aspergillas oryzae"Appl. Environ. Microbiol.. 65・9. 3873-3879 (1999)
• [文献書誌] M.Kobayashi et al.: "Genetic Analysis of Cytochrome b5 from Arachidonic Acid-Producing Fungus, Mortlerella alpina IS-4: Cloning, RNA Editing and Expression of the Gene in Escherichia coli, and Purification and chracterization of the Gene product"J. Biochem.. 125. 1094-1103 (1999)
• [文献書誌] E.Sakuradani et al.: "△9-Fatty Acid Desaturose from Aradrilonic Acid-Producing Fungus Unique Gene Sequence and its Heterdogaus Expression in a Fungus, Aspergillus"Eur. J. Biochem.. 260. 208-216 (1999)
• [文献書誌] E.Sakuradani et al.: "Identitication of △12 fatty acid desaturase from arachidonic acid-producing Mortierella fungus by heterologous expression in the yeast Saccharomyces cerevisial and the fungus Aspergillus oryzae"Eur. J. Biochem.. 261. 812-820 (1999)
• [文献書誌] S. Shimizu & J. Ogawa: "Oils, Microbial Production / Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation"John Wiley & Sons, Inc,., NY.. 1839-1851 (1999)