Ca^<2+>オシレーション誘発蛋白質の同定と作用機序の解析

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10470011
• 研究機関: 東京女子医科大学
• 研究代表者: 宮崎 俊一 東京女子医科大学, 医学部, 教授 (80010081)
• 研究分担者: 河内 全 東京女子医科大学, 医学部, 助手 (70322485) ; 淡路 健雄 東京女子医科大学, 医学部, 助手 (60297546) ; 尾田 正二 東京女子医科大学, 医学部, 助手 (50266714) ; 毛利 達磨 生理学研究所, 細胞内代謝部門, 助手 (60290912)
• キーワード: 受精 / 哺乳動物卵 / 細胞内Ca^<2+>イオン / Ca^<2+>オシレーション / 卵活性化 / 精子因子

研究概要

種々の細胞で刺激により細胞内カルシウムイオン濃度([Ca^<2+>]_1)の反復性の上昇(Ca^<2+>オシレーション)が起こる。我々は哺乳動物卵受精時にCa^<2+>オシレーションが起こることを見いだした。このCa^<2+>増加は受精卵としての活性化をもたらす。本研究は精子由来の誘発蛋白質(Ca^<2+>oscillation-inducing protein;COIP)の精製・同定と、作用機序を解析することを目的としている。平成12年度には以下の結果を得た。
1)精子を受精可能にする先体反応は細胞内Ca^<2+>上昇に依存する。マウス精子でCa^<2+>増加反応がprogesterone,8-bromo cyclic GMP,cyclic AMPの投与により誘発されることを画像で捉え、Ca^<2+>増加機序を解析した(Biology of Reproductionに発表)。
2)マウス卵受精時のCa^<2+>オシレーションの個々の[Ca^<2+>]_1上昇を、時・空間的に詳細に画像解析した(Developmental Biologyに発表)。
3)卵表面蛋白質CD9の遺伝子欠損マウスを用い、CD9が精子-卵融合の必要分子であること、融合不全で卵内Ca^<2+>は増加しないことを発見した(Nature Geneticsに発表)。
4)ハムスター精子抽出物を硫安処理・アフィニティークロマト・イオンクロマトにかけてCOIPを精製し,各画分をマウス卵に注入してCa_<2+>オシレーション誘発活性を調べた。しかし精製を重ねると活性が喪失する問題にぶつかった。複数の因子の共同作用の可能性もあり、ブタ精巣を用いて大スケールに切替えて精製中である。
5)粗精製精子因子をマウス卵に注入し、誘発されるCa^<2+>オシレーションにおける細胞内Ca^<2+>遊離と細胞外からのCa^<2+>流入の関与を、fura-2のMn^<2+>quenching法で解析した(Cell Calciumに印刷中)。

研究成果

• [文献書誌] Deguchi,R.,Shirakawa,H.,Oda,S.,Mohri,T.and Miyazaki,S.: "Spatiotemporal analysis of Ca^<2+> waves in relation to the sperm entry site and animal-vegetal axis during Ca^<2+> oscillations in fertilized mouse eggs."Developmental Biology. 218. 299-313 (2000)
• [文献書誌] Kaji,K.,Oda,S.,Shikano,T.,Ohnuki,T.,Uematsu,Y.,Sakagami,J.,Tada,N.,Miyazaki,S.and Kudo,A.: "The gamete fusion process is defective in eggs of Cd9-deficient mice."Nature Genetics. 24. 279-282 (2000)
• [文献書誌] Kobori,H.,Miyazaki,S.,and Kuwabara,Y.: "Characterization of intracellular Ca^<2+> increase in response to progesterone and cyclic nucleotide in mouse spermatozoa."Biology of Reproduction. 63. 113-120 (2000)
• [文献書誌] Mohri,T.,Shirakawa,H.,Oda,S.,Sato,M.S.,Mikoshiba,K.and Miyazaki,S.: "Analysis of Mn^<2+>/Ca^<2+> influx and release during Ca^<2+> oscillations in mouse eggs injected with sperm extract."Cell Calcium. (in press). (2001)