小腸パネト細胞機能の分子細胞生理学的研究

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10470012
• 研究機関: 岡崎国立共同研究機構
• 研究代表者: 岡田 泰伸 岡崎国立共同研究機構, 生理学研究所, 教授 (10025661)
• 研究分担者: 狭間 章博 岡崎国立共同研究機構, 基礎生物学研究所, 助教授 (60218394)
• キーワード: パネト細胞 / サイクリックAMP / CFTR / CI^-分泌

研究概要

感染防御に関与するパネト細胞は小腸腺部の奥深く少数存在するために生理学研究の対象とされず、他の腺部上皮細胞と同様にCFTRによるサイクリックAMP(cAMP)依存性CI^-分泌を行うかなど不明の点が多いままである。そこで本研究では「パネト細胞はCFTR CI^-チャネルによってCI^-分泌を行うか?」、という積年の疑問に初めて答えると共に、世界に先駆けて「パネト細胞における単一細胞レベルにおける生理学的研究」に端緒をきることが本研究の目的である。
昨年度には、このCl^-チャネルの電気生理学的性質の詳細を解析し、これまで明かになっているCFTR CI^-チャネルの性質との異同を明らかにすることができた。そこで本年度は、単一パネト細胞のmRNAをパッチ電極に回収して逆転写-遺伝子増幅(RT-PCR)を行うという単一細胞RT-PCR法(パッチRT-PCR法)を適用し、これによってパネト細胞におけるCFTR遺伝子の発現を確認すること、更にはCFTR抗体を用いてCFTR蛋白の発現をも確認することを目的とした。その結果、次の成果が得られた。
パネト細胞のCFTR遺伝子の発現の証明
パッチクランプ全細胞電流記録法によってcAMP依存性Cl^-チャネルが機能的に発現していることが確認された単一パネト細胞から細胞質を、パッチ電極内へ陰圧をかけて吸い込み、陽圧をかけてPCRチューブヘこの細胞質を回収し、これに逆転写反応をさせた上でセンスおよびアンチセンス・プライマーとポリメラーゼを加え、PCR装置を用いて遺伝子増幅させて、CFTR遺伝子の発現を確認できた。
パネル細胞におけるCFTR Cl^-チャネル蛋白の発現の証明
既にシークエンスのわかっているラットCFTRの細胞外ドメインの部分シークエンスに対する抗体をいくつか作製し、これを用いてラット単離腺における免疫染色法(蛍光抗体法)を行い、パネト細胞においてCFTR蛋白の発現を確認した。

研究成果

• [文献書誌] Hazama, Okada ら: "Swelling-induced, CFTR-independent ATP release from a human epithelial cell line. Lack of correlation with volume-sensitive CI^- channels"Jornal of General Physiology. 114. 525-533 (1999)
• [文献書誌] Sabirov, Okada ら: "Na^+ sensitivity of ROMK1 K^+ channel : Role of Na^+/H^+ antiporter"Journal of Membrane Biology. 172. 67-76 (1999)
• [文献書誌] Hazama, Okada ら: "Swelling-activated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator-augmented ATP release and Cl^- conductance in C127 cells"Journal of Physiology. 523・1. 1-11 (2000)
• [文献書誌] Okada: "A scaffolding for regulation of volume-sensitive Cl^- channels"Journal of Physiology. 520・1. 2 (1999)
• [文献書誌] Morishima, Okada ら: "Volume expansion sensitivity of swelling-activated Cl^- channel in human epithelial cells"Japanese Journal of Physiology. (in press). (2000)
• [文献書誌] Dezaki, Okada ら: "Receptor-mediated facilitation of cell volume regulation by swelling-induced ATP release in human epithelial cells"Japanese Journal of Physiology. (in press). (2000)
• [文献書誌] Fan,Morishima,Okada ら: "Control and Disease of Sodium Department Transportation Proteins and Ion Channels"Elsevier (Y. Suketa, ed.)(in press). (2000)
• [文献書誌] Shimizu,Morishima,Okada ら: "Control and Disease of Sodium Department Transportation Proteins and Ion Channels"Elsevier (Y. Suketa, ed.)(in press). (2000)