1999 年度実績報告書

遺伝子ノックアウト株の樹立を機に、平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼの細胞内機能を探る

研究課題

研究課題/領域番号	10470022
研究機関	群馬大学
研究代表者	小浜一弘群馬大学, 医学部, 教授 (30101116)
研究分担者	中村彰男群馬大学, 医学部, 助手 (30282388) 石川良樹群馬大学, 医学部, 助手 (20212863) 岡垣壮群馬大学, 医学部, 講師 (80185412)
キーワード	ミオシン軽鎖キナーゼ / ミオシン / アクチン / 平滑筋 / リン酸化 / 細胞運動
研究概要	平滑筋は通常は収縮型細胞で構成されるが、血管病変では増殖型が現れる。アクトミオシン系は前者では収縮を起こすが、後者では細胞質分裂・遊走能を担っている。このアクトミオシン系に対し、ミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)は重要な制御蛋白質と考えられている。しかし、この考えはin vitroでのもので、in vivoでは問題が多い。血管平滑筋由来のSM3株を母体とし、MLCK遺伝子発現を阻止した株(SM3・MLCK-)の樹立にどこよりも先に成功した。これを機に、MLCKに関連し、in vivoで以下の点に於いて解析する計画をたてた。i) SM3・MLCK-とそのコントロールの比較により、MLCK遺伝子発現阻止によりどのような変化が起こるか?検討を加える。ii)MLCKのアクチン結合部の導入による機能回復はどの項目か?レスキュー実験により検討を加える。iii)MLCKキナーゼ部位とミオシン結合部位をそれぞれ導入し、回復する機能はあるか?検討をする。iv)MLCK遺伝子発現阻止(ノックアウト)を、今度は、増殖を伴う血管病変モデル動物で試みる。本年度には以下のような成果が得られた。方法:MLCKをノックアウトしてSM3・MLCK-株とコントロール株をカバーグラス上に培養し、トリトンX100を含むフォルムアルデヒドで固定する。細い線維はローダミンでラベルされたフォロイジン(市販)を用いアクチン染色で、太い線維は平滑筋ミオシン重鎖抗体(現有)によるミオシン染色で検出する。検出には現有の蛍光顕微鏡を用いる。結果:昨年度には運動性の細胞に特有なmembrane rufflingがSM3・MLCK-株では欠損している事をみつけたが、本年度ではプラスミドにMLCK・cDNAをセンス方向に組み込んだconstructを作成し、SM3・MLCK-株に導入し、レスキューを行った。これによりmembrane rufflingはSM3と同様に発生することが明らかとなった。さらにレスキュー実験を発展させるため、アデノウイルスベクターにMLCK・cDNAをセンス方向に組み込んだ。現在感染力の高いconstructを得つつあるが、cDNAのどの部分がレスキューを行うか?検討したい。

研究成果

(7件)

すべてその他

すべて文献書誌 (7件)

[文献書誌] Kishi,H. et al: "Stable transfectants of smooth muscle cell line lacking the expression of myosin light chain kinase and their characterization with respect to the actomyosin system"J.Biol.Chem.. 275. 1414-1420 (2000)
[文献書誌] Ye,L.-H. et al: "Myoshin light-chain kinase of smooth muscle stimulats myosin ATPase activity without phosphorylating myosin light chain"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.. 96. 6666-6671 (1999)
[文献書誌] Fujita,K. et al: "Myoshin light chain kinase from skletal muscle regulates an ATP-dependent interaction between actin and myosin by binding to actin"Mol.Cell Boil.. 190. 85-90 (1999)
[文献書誌] Nakamura,A. et al: "Calcium regulation of the actin-myosin interaction of Physarum polycephalum"Int.Rev.of Cytol.. 19. 53-98 (1999)
[文献書誌] Hayakawa,K. et al: "Characterization of the myosin light chain kinase from smooth muscle as an actin-biding protein that assembles actin filament in vitro"Biochim.Biophys.Acta.. 1450. 12-24 (1999)
[文献書誌] Iwasaki,W. et al: "Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of a 40kDa calcium binding protein specifically expressed in plasmodia of Physarum polycephalum"J.Biochem.. 126. 7-9 (1999)
[文献書誌] Kohama,K. and Sasaki,Y.: "Molecular Mechanisms of smooth muscle contraction"R.G.Landes Company. 167 (1999)

1999 年度 実績報告書

遺伝子ノックアウト株の樹立を機に、平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼの細胞内機能を探る

研究代表者

小浜 一弘 群馬大学, 医学部, 教授 (30101116)

研究成果

[文献書誌] Kishi,H. et al: "Stable transfectants of smooth muscle cell line lacking the expression of myosin light chain kinase and their characterization with respect to the actomyosin system"J.Biol.Chem.. 275. 1414-1420 (2000)

[文献書誌] Ye,L.-H. et al: "Myoshin light-chain kinase of smooth muscle stimulats myosin ATPase activity without phosphorylating myosin light chain"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.. 96. 6666-6671 (1999)

[文献書誌] Fujita,K. et al: "Myoshin light chain kinase from skletal muscle regulates an ATP-dependent interaction between actin and myosin by binding to actin"Mol.Cell Boil.. 190. 85-90 (1999)

[文献書誌] Nakamura,A. et al: "Calcium regulation of the actin-myosin interaction of Physarum polycephalum"Int.Rev.of Cytol.. 19. 53-98 (1999)

[文献書誌] Hayakawa,K. et al: "Characterization of the myosin light chain kinase from smooth muscle as an actin-biding protein that assembles actin filament in vitro"Biochim.Biophys.Acta.. 1450. 12-24 (1999)

[文献書誌] Iwasaki,W. et al: "Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of a 40kDa calcium binding protein specifically expressed in plasmodia of Physarum polycephalum"J.Biochem.. 126. 7-9 (1999)

[文献書誌] Kohama,K. and Sasaki,Y.: "Molecular Mechanisms of smooth muscle contraction"R.G.Landes Company. 167 (1999)

1999 年度実績報告書

小浜一弘群馬大学, 医学部, 教授 (30101116)