緑膿菌のマルチコンポーネント型多剤排出システムの作動機構とその分子構造の解明

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10470070
• 研究機関: 京都薬科大学
• 研究代表者: 後藤 直正 京都薬科大学, 薬学部, 助教授 (30121560)
• 研究分担者: 辻元 秀人 京都薬科大学, 薬学部, 助手 (10257777) ; 津田 政孝 東北大学, 遺伝生態研究センター, 教授 (90172022) ; 西野 武志 京都薬科大学, 薬学部, 教授 (50097838)
• キーワード: 緑膿菌 / 多剤排出システム / 異物排出 / 免疫沈降 / キメラ排出システム / トポロジー / 基質認識 / MexC-MexD-OprJ

研究概要

緑膿菌のRNDファミリーコンポーネントMexD、MFPコンポーネントMexCおよびチャンネル形成コンポーネントOprJからなるマルチコンポーネント型多剤排出システムをモデルとして、その基質認識の本体の同定と排出システムの構造について研究を進め、下記のような結果を得た。
1)基質認識の本体の同定のために、染色体上にコードされた幾つかの排出システムとMexDを欠失した変異株ム陰性菌のRNDファミリータンパク質(マルチコンポーネント型排出システムの内膜コンポーネント)をコードする遺伝子配列をPCR増幅し、広宿主域プラスミドにクローン化した。得られたプラスミドでKG4501を形質転換し、その性状の変化を調べたところ、明らかにRNDファミリーコンポーネントが基質認識を担う本体であることが分かった。また、トポロジー解析からRNDコンポーネントは約300個のアミノ酸からなる巨大なループ構造を2箇所に持つ12回膜貫通構造をとっていることが示された。
2)コンポーネントを欠損した変異株の解析をすでに作成した各コンポーネントに特異的な抗体を用いた免疫沈降実験から行ったところ、コンピューター解析から予測されたように、RNDコンポーネントは内膜に、MFPコンポーネントはペリプラスムに互いにリンクして局在し、それらに外膜コンポーネントがリンクしていることが分かった。さらに、ペリプラスムコンポーネントのN末端とC末端のそれぞれが、内膜と外膜に組み込まれた形で存在することが分かった。
以上の結果をもとに次年度は、RNDファミリーコンポーネント内で基質認識のために機能するアミノ酸残基の同定と活性発現時の排出システムの構造の解明を進めることを計画している。

研究成果

• [文献書誌] Nobuhisa Masuda: "Interplay between Chromosomal b-lactamase and the MexAB-OprM Efflux System in Intrinsic Resistance to b-iactams is Pseudomonas aeruginosa"Antimicrob.Agents Chemother.. 43. 400-402 (1999)
• [文献書誌] Kiyomi Okamoto: "Molecular cloning of oprQ encoding to the outer membrane protein OprE3 of Pseudomonas acruginosa"Microbiol.Immunol.. 43. 297-301 (1999)
• [文献書誌] Naomasa Gotoh: "Topological analysis of an RND family transporter,MexD of Pseudomonas aeruginosa"FEBS Lett.. 458. 32-36 (1999)
• [文献書誌] Shah Jalal: "Rapid identifcation of mutations in a multidrug efflux pump in Pseudomonas aeruginosa"APMIS. 107. 1109-1116 (1999)
• [文献書誌] Hideto Tsujumoto: "Diffusion of macrolide antibiotics thruough the outer membrane of Moraxella catarrhalis"J.Infect.Chemother.. 5. 196-200 (1999)
• [文献書誌] Shah Jalal: "Mutations to quinolone resistance in Pseudomonas aeruginasa and Enterococcus faecjum."Drugs. 58. 119-120 (1999)
• [文献書誌] Naomasa Gotoh: "Multidrug efflux systems in Pseudomonas aeruginosa:their contribution to the multidrug resistance in cooperation with other resistance factors."Chin.Microbiol.Infect.. 5. 5S60-5S61 (1999)
• [文献書誌] T.Mizote: "Cloning and characterzation of the thiD/J gene of Escherichia cole incoding a thiamin-synthesizing bifunctional enzyme,hydroxymethylpyrimidine kinase/phosphomethylpyrimidine kinase."Microbiology. 145. 495-501 (1999)
• [文献書誌] Masataka Tsuda: "Mobile Catabolic Genes in Bacteria."J.Biosci.Bioeng.. 87. 401-410 (1999)
• [文献書誌] Shah Jalal: "Mechanisms of resistance to fluoroquinolones in Pseudomonas aeruginosa from cystic fibrosis patients."Antimicrob.AgentsChemother.. (in press). (2000)
• [文献書誌] 高山 吉弘: "nfxB型排出蛋白をもつPseudomonas aeruginosaに対するfosfomycinとcefepimeの併用効果"日本化学療法学雑誌. 47. 264-270 (1999)
• [文献書誌] 後藤 直正: "緑膿菌の多剤耐性化に寄与する薬剤排出システム"日本化学療法学雑誌. 47. 319-328 (1999)
• [文献書誌] 後藤 直正: "キノロン耐性-複数の機構の総和"医学のあゆみ. 191. 1031-1035