高次脳機能発達における神経特異プロテオグリカンNGCの発生工学的機能解析

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10470159
• 研究機関: 愛知県心身障害者コロニー発達障害研究所
• 研究代表者: 大平 敦彦 愛知県心身障害者コロニー発達障害研究所, 周生期学部, 部長 (20101074)
• 研究分担者: 時田 義人 愛知県心身障害者コロニー発達障害研究所, 周生期学部, 研究員 (50291175) ; 青野 幸子 愛知県心身障害者コロニー発達障害研究所, 周生期学部, 主任研究員 (20231780)
• キーワード: 脳 / 発生工学 / site-directed mutagenesis / ノックアウトマウス / プロテオグリカン / ニューログリカンC / コンドロイチン硫酸 / パートタイムプロテオグリカン

研究概要

ニューログリカンC(NGC)は、私達がcDNAのクローニングに成功した神経特異的膜貫通型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンである。本研究の目的は、脳の機能発達におけるNGCの役割を、主に発生工学的手法で解明することである。本年度の進捗状況は次の通りである。
1.NGCノックアウトマウスの作製
Cre-lox Pシステムのターゲティングベクターを用いて相同組み換えを起こしたES細胞のクローンを5株得た。2株から、90%以上の高いキメラ率を示す雄キメラマウスが得られた。現在、これらをC57B雌マウスと交配・繁殖し、ヘテロ接合体の誕生を待っている。
2.NGC細胞外ドメインの動物細胞による発現と生理活性の検索
EGFファミリー分子としてのNGCの神経保護活性やグリア細胞の分化・増殖制御活性を調べることを目的として、C-末端にHISタグを結合したNGCの細胞外ドメインをマウス神経芽腫由来Neuro2a細胞に発現させ、培養液に分泌されるリコンビナント融合タンパクの精製を試みた。コンドロイチン硫酸(CS)側鎖を結合したプロテオグリカン型融合タンパクが分泌されることが確認できたが、HISタグが分解除去されてしまうため、精製が困難であった。現在、別のタグとの融合タンパクを作製する準備を進めている。
3.Site-directed mutagenesisによるCS側鎖導入部位の決定
NGCは、パートタイムプロテオグリカンであり、CS側鎖の有無により機能が異なることが予想される。CS側鎖が導入されうるセリン残基を、個々にアラニン残基に変えることにより、CS側鎖が導入されている部位を調べたところ、NGCは、123番目のセリン残基に1本だけCS側鎖を結合していることが明らかとなった。

研究成果

• [文献書誌] Richard A.Asher et al.: "Neurocan is up-regulated in injured brain and in cytokine-treated astrocytes."Journal of Neuroscience. 20(7). 2427-2438 (2000)
• [文献書誌] Masaru Inatani et al.: "Upregulated expression of neurocan, a nervous tissue specific proteoglycan, in transient retinal ischemia."Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41. 2748-2754 (2000)
• [文献書誌] Atsuhiko Oohira et al.: "Effects of lipid-derivatized glycosaminoglycans (GAGs), a novel probe for functional analyses of GAGs, on cell-to-substratum adhesion-"Archives of Biochemistry and Biophysics. 378. 78-83 (2000)
• [文献書誌] Kohji Kasahara et al.: "Involvement of gangliosides in glycosylphosphatidylinositol-anchored neuronal cell adhesion molecule TAG-1 signaling in lipid rafts."Journal of Biological Chemistry. 275(44). 34701-34709 (2000)
• [文献書誌] Masaru Inatani et al.: "Neuroglycan C, a neural tissue-specific transmembrane chondroitin sulfate preteoglycan, in retinal network formation."Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41. 4338-4346 (2000)
• [文献書誌] Yoshihito Tokita et al.: "Regulation of neuregulin expression in the injured rat brain and cultured astrocytes."Journal of Neuroscience. 21(4). 1257-1264 (2001)