血液細胞の増殖・分化に関与するガングリオシドGM3合成酵素遺伝子の発現機構と応用

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10470206
• 研究機関: 国立がんセンター
• 研究代表者: 齋藤 政樹 国立がんセンター研究所, ウイルス部, 部長 (60012762)
• 研究分担者: 堺 隆一 国立がんセンター研究所, ウイルス部, 室長 (40215603) ; 松田 和洋 国立がんセンター研究所, ウイルス部, 主任研究官 (80251502) ; 石井 睦 国立がんセンター研究所, ウイルス部, 室長 (20232225)
• キーワード: ガングリオシドGM3合成酵素 / シアル酸転移酵素 / ルシフェラーゼ活性 / GM3合成酵素欠損マウス / TATA・CAAT配列 / シアリルモチーフ / Sp1結合部位 / プロモーター活性

研究概要

昨年度に引き続き平成12年度は、ガングリオシドGM3合成酵素遺伝子の発現制御機構を解析し、以下の諸点を明らかにした:ヒトGM3合成酵素遺伝子(hSAT-1)の転写開始点上流領域約11kbpをサブクローン化し、塩基配列を決定するとともに、段階的欠失変異クローンを作製し、ルシフェラーゼ活性をレポーターとしてプロモーター活性を測定した。宿主細胞として、大腸癌細胞HCT116と神経芽細胞腫SK-N-MCを用いた。また発現ベクターpCEV18にhSAT-1のcDNAを組み込んだplasmid(pCEV18koz-hSAT-1)を導入遺伝子として、GenePORTERを使いHCT116細胞にhSAT-1を導入した。ヒトGM3合成酵素遺伝子転写開始点近傍は、GCに富んだ配列を示した(82%)。また、5'上流域には、典型的なTATA・CAAT配列の組み合わせは存在せず、多種の転写因子結合配列が同定された。ヒトでの本遺伝子の発現は、脳・骨格筋・精巣等で比較的高く、消化管・腎等で低かった。そこで、SK-N-MCとHCT116細胞における発現をノーザン解析により調べた結果、正常組織における発現パターンを反映していたので、宿主細胞とした。HCT116細胞では、全ての欠失変異体でルシフェラーゼ活性は低く、ノーザン解析の結果を支持した。また、転写開始点近傍(-101〜+104)域に細小プロモーター活性があることが判明した。一方、SK-N-MC細胞では-286塩基までの欠失変異体導入時に最大のプロモーター活性を示した。更に、-286塩基までの欠失変異体に比べ、-102塩基までの欠失変異体ではルシフェラーゼ活性が55%に減少したことから、この領域に神経芽細胞腫における本遺伝子発現を調節する転写因子の結合部位が存在する事が示唆され、検索の結果Sp1部位が同定された。Sp1結合部位は、転写開始点近傍に更に2ケ所同定されたので、本遺伝子発現におけるSp1の重要性を確かめるため、Sp1結合部位の段階的欠失変異体を作製し、SK-N-MC細胞を用いてレポーター測定をしたところ、Sp1結合部位一つの欠失につき約半分程度のプローモーター活性の減少が見られた。一方、ヒト大腸癌HCT116細胞にhSAT-1を導入すると、GM3合成酵素活性の上昇、GM3分子の増加と共に、アポトーシスが誘導されることが判明した。

研究成果

• [文献書誌] Tanaka,T.,Saito,M., et al.,: "Hepatitis C Viruses NS5B RNA Replicase Specifically Binds Ribosomes."Microbiol.Immunol.,. 44(6). 543-550 (2000)
• [文献書誌] Matsuda,K.,Saito,M., et al.,: "Monoclonal Antibody against Mycoplasma fermentans-Specific Aminoglycoglycerolipid."Microbiol.Immunol.,. 44(8). 695-702 (2000)
• [文献書誌] Ikeda,M.,Saito,M., et al.: "Characterization of antiviral activity of lactoferrin against hepatitis C virus infection in human cultured cells"Virus Res. 66. 51-63 (2000)
• [文献書誌] Nakamoto,T.,Sakai,R., et al.: "CIZ, a zinc finger protein that interacts with p130 (cas) and activates the expression of matrix metalloproteinases."Mol.Cell.Biol.. 20. 1649-1658 (2000)
• [文献書誌] Matsumoto,S.,Saito,M., et al.,: "Expression and characterization of the active form of human ganglioside GM3 synthase in Escherichia coli as MBP-fusion protein."Biochem.Biophys.Res.Commun.,. (in press).
• [文献書誌] Matsuda,K.,Saito,M. et al.: "HIV Induction from Latently Infected Cells by Phosphoglycolipid Antigens of Mycoplasma fermentans."Infect.Immun.. (in press).
• [文献書誌] 石井睦,齋藤政樹: "日本生化学会編"基礎生化学実験法"第5巻脂質・糖質・複合糖質 第17-5章 ガングリオシド"東京化学同人. 350 (2000)
• [文献書誌] Ikeda,M.,Saito,M., et al.,: "Antiviral activity of lactoferrin against HCV infection in human cultured cells. In : Lactoferrin : Structure, Function and Applications,"edited by K.Shimazaki et al., Elsevier Science B.V.,. 225 (2000)