| 研究概要 |
NIDDMモデルマウスの膵β細胞に、抗酸化酵素の一つであるglutathione peroxidase(GSHPx.)を強制発現させることにより、β細胞glucose toxicityにおける酸化ストレスの意義を明らかとすべく実験を進めている。膵β細胞への選択的発現は、GSHPxのcoding sequenceをinsulin promoterの下流に組み込んだplasmidを作成することにより実施している。
既に、現在までにC57BL/Ksマウスの受精卵約200個にDNAをinjectし、十数匹の出生を見た。そのうち、3匹のF0においてDNAレベルでの遺伝子組み込みが確認された。あいにく、accidentにより、うち2匹が死亡し、現在、一系統のみでF0およびF1が得られるに至っている。近く、マウスの数が増えるのを待って、膵組織染色にてGSHPxの発現を解析する予定である。抗GSHPx抗体は、transgene由来(ヒト)のGSHPxに加えて、マウス内因性のGSHPxをも認識する。従って、外来性GSHPx(transgene)が膵β細胞において発現していることは、一つは発現量の差により、そしてもう一つは、mRNAのnon-coding leader sequenceが内因性のGSHPXと異なることを利用し、RT-PCRを行うことにより確認する。
また、同時進行でtransgenicマウスにはC57BL/Ks db/-マウスとの交配により既にdb遺伝子を付加しつつあり、膵でのtransgene発現が確認され次第、糖尿病発症に与える影響の検討を始めることが可能となっている。経時的に、糖負荷テスト、islet mass測定、免疫組織染色(Insulin,Glucagon,Glucokinase,PDX-1,NeuroD,Oct-1)、competitive RT-PCRによる単離膵島内mRNA量測定(insulin,Glucagon,GLUT2,Glucokinase,PDX-1,NeuroD,β-actin)を行う予定である。
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