インテリジェント・ターゲッティングシステムを用いた難治性癌に対する遺伝子治療

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10470254
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 柳衛 宏宣 東京大学, 医科学研究所, 助手 (30212278)
• 研究分担者: 丸山 一雄 帝京大学, 薬学部, 助教授 (30130040) ; 佐藤 智典 東京工業大学, 生命理工学部, 助教授 (00162454) ; 谷 憲三郎 東京大学, 医科学研究所, 助教授 (00183864)
• キーワード: 非ウイルスベクター / ドラッグデリバリーシステム / 遺伝子治療 / 癌抑制遺伝子 / カチオニックリボソーム / ステルスリボソーム / Qplex / キトサン

研究概要

現在の遺伝子治療で用いられているウイルスベクターは、程度の差こそあれ免疫応答や炎症などを引き起こし、反復投与を阻むことになる。このためウイルスに代わる安全な遺伝子導入用ベクターの開発が必須であり、研究を進めた。
1)Liposomeのstelth化によるDrug delivery systemの開発: 我々は、Liposomeの表面をPolyethylene glycolで修飾することにより、細網内皮系による捕捉を回避し、血中滞留性が著しく向上するStealth liposomeを開発した。 AsPC-1あるいはColon26担癌マウスに ^<10>B封入Stealth liposomeを静脈注射後、60時間経過しても腫瘍内^<10>Bを40ppm以上保つことをPlasma emmision spectroscopyにて確認し、この濃度は中性子捕捉療法(BNCT)を行うのに十分量であった。さらに、2x10^<12>n/cm^2の熱中性子を照射し、BNCTを行うと、腫瘍特異的に増殖抑制を認めた。
2)新規Lipoplex(Quarternary comlex,Qplex )の開発: Cationic liposomeとplasmid DNAとの複合体いわゆるLipoplexを用いた遺伝子導入が盛んに行われている。我々は、LipoplexにprotamineおよびLigandとしてtransferrin(TF)を添加した4成分からなる複合体(Quarternary complex,Qplex )を開発した。plasmid DNAはβ-galactosidaseをコードしたものを、細胞としてはCOS7、AsPC-1を用いた。LipoplexおよびLipoplexにprotamineまたはTFのみを添加した複合体に比べて、Qplexはいずれの細胞に対しても著しく高い発現を示した。
3)Chitosanをキャリアーとした遺伝子の細胞内導入: Plasmid/Chitosan複合体において、Chitosanの分子量依存的に発現活性と細胞内への取り込み量の相関関係が確認された。分子量が40kDaのChitosanで最大の発現活性が見られた。培地中の血清濃度が10%において発現活性がより高くなることが確認され、また、細胞毒性が低いことから、生体内での利用の可能性を示した。Plasmid/Chitosan複合体の遺伝子発現機構の解析を行った。その結果、1)細胞内への取り込みはendocytosisであり、2)endosomeから細胞質への放出はバッファリング効果により複合体のままで放出され、さらに3)複合体が核へ集積していることが確認された。
来年度は、これらの、新規Non-viral vectorを用いて癌抑制遺伝子(tob,NG-1,p53)を導入し、in vitro、in vivoにおける腫瘍抑制効果を確認し、臨床応用へと発展させたい。

研究成果

• [文献書誌] H. Yanagie, et al.: "Application of ^<10>B entrapped PEG-liposome to boron neutron-capture therapy for pancreatic cancer model in vivo"Neutron Imageing Methods to Detect Defects in Materials. 709-715 (1999)
• [文献書誌] H. Yanagie, et al.: "Neutron capture autorodiographic determination of ^<10>B distributions and concentrations in biological samples for boron neutron capture therapy"Nuclear instruments and Methods in Physics Research A. 424. 122-128 (1999)
• [文献書誌] K. Maruyama, et al.: "Molecular localization and state of amphotericin B in PEG liposomes"Int. J. Pharm.. 193. 97-106 (1999)
• [文献書誌] O. Ishida, K. Maruyama, et al.: "Size-dependent extravasation and interstitial localization of polyethylene glycol liposomes in solid tumor-bearing mice"Int. J. Pharm.. 190. 49-56 (1999)
• [文献書誌] K. Maruyama, et al.: "Possibility of active targeting to tumor tissues with liposomes"Advanced Drug Delivery Reviews. 40. 89-102 (1999)
• [文献書誌] O. Ishida, K. Maruyama, H. Yanagie, et al.: "Targeting-chemotherapy to Solid Tumors with Long-Circulating Thermosensitive Liposomes and Local Hyperthermia"Jpn. J. Cancer Res.. 91. 118-126 (2000)
• [文献書誌] K. Maruyama et al.: "Liposomes bearing polyethyleneglycol-coupled tronsterrin show high extravasation and internalization into targeted solid tumors in vivo"Biochem. Biophys. Acta. (in press).
• [文献書誌] T. Sato et al.: "In vitro gene delivery mediated by chitosan"Proceed. Int'l Symp. Control Rel. Bioact. Mater.. 26. 803-804 (1999)
• [文献書誌] T. Ishii, T. Sato et al.: "Facile Preparation of a Fluoresoence-labeled Plasmid"Chem. Lett.. (in press).
• [文献書誌] Yanagie et al.: "Inhibition of human pancreatic cancer growth by the liposomal delivery of a novel growth suppressing gene "tob" in vitro"Reseach in Experimental Medicine. (on press).
• [文献書誌] T. Sato: "Biomedical Polymers and Polymer Therapeutics"Kluwer Academic/Plenum Publishing (in press).