| 研究概要 |
臨床標本では非常に多くの正常細胞中に存在する僅かな異常細胞を検出することが必要とされる.このような場合には,通常の遺伝子変異の検出法では不可能であり,はるかに感度の高い検出法が必要とされる.Enriched PCR法は,PCR-RFLP法をもとにして開発された技術で,正常DNA10^5〜10^6個中の1個のmutant DNAを検出することが期待されている手法であるが,偽陽性の多いことが問題とされている.我々は,その理由の一つを,増幅に用いるTaq DNAポリメラーゼの塩基読み違えが原因と考え,PCR反応にTaq以外の3'to 5'proofreading exonuclease activityを持つDNAポリメラーゼを用いることにより偽陽性を減少させることを試みた.
本年の研究結果としては,Vent DNAポリメラーゼおよびPfu DNAポリメラーゼに関して塩基の読み違えによる取り込みの誤りを検討した.種々のMg濃度,DNAポリメラーゼ濃度,dNTP濃度での検討を行い,それらがそれぞれTaq DNAポリメラーゼの数分の一および数十分の一であることを確認した.次に,肺癌で高率に変異が見いだされているK-ras遺伝子の点突然変異に関し,GGTからGTTおよびGGTからTGTへの変異に焦点を合わせ,その細胞株を用いて,PCR-RFLPの至適条件を設定した.さらに,同じ細胞株を用いて,PCR-RFLP法を2回組み合わせることになるEnriched PCR法の至適条件を現在検討中である.
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