ヒト卵透明帯蛋白を発現するトランスジェニックマウスの作成と精子機能検査への応用

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10470350
• 研究機関: 兵庫医科大学
• 研究代表者: 香山 浩二 兵庫医科大学, 医学部, 教授 (00068496)
• 研究分担者: 小森 慎二 兵庫医科大学, 医学部, 講師 (60195865) ; 赤谷 昭子 (長谷川 昭子) 兵庫医科大学, 医学部, 助手 (50212402)
• キーワード: 卵透明帯 / ZPA / 受精 / 受精能獲得 / 精子レセプター / 先体反応 / 不妊症

研究概要

この研究の目的は、受精機能と密接に関わるヒト卵透明帯タンパクZPAをマウス卵巣で発現させ、通常実験材料や検査・材料として用いることのできないヒト卵透明帯を遺伝子組換えマウスから供給し、ヒト精子の機能検査、不妊症の原因解明、受精機構の解明に応用することである。
1 導入する遺伝子の構築
(1)米国NIHのDr.Jurrien Deanより供与を受けた、マウスZPAゲノムDNA断片(約2.4kb)から850ベースのプローブを作成し、マウスゲノムライブラリーをスクリーニングした。その結果、マウスZPAのプロモーター部分を含む120KbのDNA断片を得た。現在、Sma1あるいはXba1により得られる約20Kの断片にプロモーター領域を確認しているが、さらに6K程度にしぼる予定である。
(2)すでに保有しているブタZPAミニジーンに、プロモーターとして機能することが報告されているマウスZPAゲノムDNA(1.2kb)の5'flanking領域を接続して、8.7kbのトランスジーンを構築した。
(3)ヒトZPAをコードする遺伝子を単離するため、米国NIHのDr.Jurrien Deanより供与を受けたヒトZPAゲノムDNA断片(9.4bp)をもとに、ヒトゲノムライブラリースクリーニング中である。
2 トランスジェニックマウスの作出
(1)上記(2)のトランスジーンをQiaexにより精製し、DNA濃度を80.4ng/mlとして保存した。前核に注入するときはT10E0.2で10倍希釈した。
(2)B6DBAF1/JメスマウスにPMS/hCGを投与して過剰排卵処理を行い、同系オスマウスと交配し卵管より前核期胚を回収した。
(3)平成10年度設備備品として購入したマイクロピペットプーラーにて注入針を作成し、同じく購入の設備備品、マイクロマニプレーター付倒立顕微鏡システムとマイクロインジェクターを用いて、前核期胚雄性前核にトランスジーンを注入した。
(4)トランスジーンを注入した胚は2細胞期胚まで培養し、ICR系の偽妊娠メスマウスの卵管に移植した。現在、出生したマウスにトランスジーンが導入されているかどうか、検査中である。

研究成果

• [文献書誌] Akiko Hasegawa Hiroshi Tsubamoto and Koji Koyama: "Evaluation of the contraceptive potential of recombinant protein and synthetic peptides of zona pellucida (ZP)"J.Mamm.Ova Res.. 16・3. 86-93 (1999)
• [文献書誌] Hiroshi Tsubamoto,Akiko Hasegawa,Yuko Nakata,Shirai Naito,Noriyuki Yamasaki and Koji Koyama: "Expression of recombinant human zona pellucida protein 2 and its binding capacity to spermatozoa"Biol.Reprod.. 61. 1649-1654 (1999)
• [文献書誌] Hiroshi Tsubamoto,Noriyuki Yamasaki,Akiko Hasegawa and KoJii Koyama: "Expression of a recombinant porcine zona pellucida glycoprotein 1 in mammalian cells"Protein Expression and Purification. 17. 8-15 (1999)
• [文献書誌] Akiko Hasegawa,Hiroshi Tsubamoto,Yukari.Hamada and Koji Koyama: "Blocking effect of antisera to recombinant zona pellucida proteins (r-ZPA) on in vitro fertilization"Am.J.Reprod.Immunol. (in press).