新規軟骨由来多機能成長因子エコジェニン/CTGFの作用機構に関する研究

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10470389
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 滝川 正春 岡山大学, 歯学部, 教授 (20112063)
• 研究分担者: 西田 崇 岡山大学, 歯学部, 教務員 (30322233) ; 服部 高子 岡山大学, 歯学部, 助手 (00228488) ; 中西 徹 岡山大学, 歯学部, 助教授 (30243463)
• キーワード: エコジェニン / CTGF / 軟骨細胞 / 細胞分化 / 細胞増殖 / MAPK / ELK

研究概要

1.Elk発現ベクターあるいはAtf発現ベクターと蛍ルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだレポーターベクターpTRE-lucを共感染させたHCS-2/8細胞を用いて、エコジェニン/CTGFが、ELKのリン酸化活性を約5倍に、p38MAPKのリン酸化活性を約2倍に促進すること見いだした。また、それぞれの阻害剤により濃度依存的にそのリン酸化は抑制された。さらに、Western blotでもELKのリン酸化と、p38MAPKのリン酸化が亢進することを明らかにした。
2.エコジェニン/CTGFのDNA合成促進作用はPD098059により阻害され、プロテオグリカン合成促進作用はSB203580により選択的に阻害された。
以上の結果、軟骨細胞に対するエコジェニン/CTGFの増殖促進作用はERKの経路を、分化促進作用はp38MAPK経路を介していることが明らかとなった。
3.ヒト軟骨細胞様細胞株HCS-2/8より、2種のエコジェニン/CTGF結合タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーにて精製した。そのうちの一つの分子量42KDaのタンパクのN末端の部分アミノ酸配列はγ-アクチンのそれと一致した。また、50KDaのタンパクのN末端の部分アミノ酸配列はサイトケラチンのそれと一致した。また、放射能標識したエコジェニン/CTGFはヒト血小板由来のγ-アクチンと結合した。
4.エコジェニン/CTGFをHeLa細胞に強制発現させると、細胞質に均等に分布せず中心体近傍に局在した。
5.一方、HCS-2/8細胞を放射性メチオニンでpulse-chaseしたのち免疫沈降してエコジェニン/CTGFの合成後の動態を調べると、細胞外マトリックス合成後は細胞側に蓄積する一方、C-末フラグメントが細胞内に存在することが判明した。
したがって、エコジェニン/CTGFは一旦細胞外マトリックスに備蓄されたのち働くだけでなく、分泌されずにγ-アクチン等に結合して細胞内で直接効果を発揮する経路も存在することが示唆された。

研究成果

• [文献書誌] Sato,S.: "Serum levels of connective tissue growth factor are elevated in patients with systemic sclerosis : Association with the extent of skin sclerosis and the severity of pulmonary fibrosis"Journal of Rheumatology. 27. 149-154 (2000)
• [文献書誌] Nishida,T.: "Effects of CTGF/Hes24,a hypertrophic chondrocyte-specific gene product, on the proliferation and differentiation of osteoblastic cells in vitro "J.Cell.Physiol.. 184. 197-206 (2000)
• [文献書誌] Shakunaga,T.: "Expression of connective tissue fgrowth factor in cartilaginous tumors "Cancer. 89. 1466-1473 (2000)
• [文献書誌] Kubota,S.: "Novel intracellular effects of human connective tissue growth factor expressed in Cos-7 cells."FEBS Letters. 474. 58-62 (2000)
• [文献書誌] Kubota,S.: "Identification of an RNA element that confers post-transcriptional repression of connective tissue growth factor/hypertrophic chondrocyte specific24 (ctgf/hcs24) gene : Similarities to retroviral RNA-protein interactions."Oncogene. 19. 4773-4786 (2000)
• [文献書誌] Takigawa,M.: "Tissue Engineering for Therapeutic Use"Physiological roles of connective tissue growth factor (CTGF/Hcs24) : promotion of endochondral ossification, angiogenesis and tissue remodeling. 192 (2000)