| 研究課題/領域番号 |
10470446
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
山本 照子 岡山大学, 歯学部, 教授 (00127250)
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| 研究分担者 |
山下 和夫 岡山大学, 歯学部, 助手 (50304316)
宮本 学 岡山大学, 歯学部, 助手 (40252978)
山城 隆 岡山大学, 歯学部, 講師 (70294428)
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| キーワード | 歯根膜細胞 / クローン分析 / アルカリファスファターゼ / trkA |
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| 研究概要 |
クローン分析の手法を用いて分化段階に応じて単一の歯根膜細胞から由来するコロニーを分離することにより多様な形質を発現する歯根膜細胞を均一な細胞集団毎に分離・培養して、歯根膜細胞の培養系を確立することと、その培養系を用いて歯の移動における歯根膜細胞の役割を解明することを目的に以下の実験を行った。
矯正治療の必要性で抜歯と決定された小臼歯や第三大臼歯の歯根から歯根膜を剥離し、細片にして、培養ディシュにのせ、10%ウシ胎仔血清含有Dalbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)で培養した。培養を続けると10日〜2週間後に細長い線維芽細胞様の細胞がアウトグロースして歯根膜組織片のまわりの培養ディシュを被うようになり、さらに培養を続けてゆくと丸い形の細胞が次にアウトグロースしてくる。20日頃にはその様な丸い形の細胞が歯根膜組織片のまわりを囲いその外側に先にアウトグロースした細長い線維芽細胞様の細胞が培養される。また、これらの中間の形態をした細胞も培養ディッシュを位相差顕微鏡で調べると、ところどころにひとかたまりになって存在していた。次に継代数と細胞形態、細胞増殖能の検討を行ったところ、15-20継代で本来の機能を喪失した。そこで歯根膜を歯根表面より剥離した後、コラゲナーゼおよびトリプシン処理を行い、細胞障害性が可及的に少なく、個々の細胞に分離する手法を確立した。組織片を酵素処理した場合、様々な形態の細胞が培養ディッシュに付着し、主に線維芽細胞様細胞が増殖した。これらの細胞のうち線維芽細胞様細胞以外は免疫染色法によりcytokeratin抗体に染色された。Cytokeratin陽性細胞はマラッセの上皮残遺由来と考えられ、ラット歯根膜の免疫染色の結果から神経栄養因子のレセプター、trkAがマラッセの上皮残遺由来の上皮細胞に特徴的に発現していることが明らかになったことより、ヒト歯根膜の初代培養系でのtrkAの発現様相を検討中である。現在、このような形態的に異なる細胞の特徴を免疫組織化学的、分子生物学的手法にて解析中である。さらに、96wellにて単一細胞に分離分散した歯根膜線維芽細胞を培養し、数種のクローンを分離してヌードマウスへの移植組織片を作成した。ラットを用いたin vitroの実験により歯の移動における歯根膜細胞の役割を検討した。
これらの知見は現在国際誌に受領済,投稿中,投稿準備中である。
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