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本研究では、蛍光標識を導入した蛋白質のフォールディング反応を、単一分子レベルで測定することを目的として、研究を行っている。昨年度の研究により、分子シャペロンGroELと基質蛋白質の相互作用を、蛍光顕微鏡を用いて、単一分子レベルで観測することが可能となった。今年度は、それを進展させ、以下の成果を得た。
1.基質の単一分子レベルでの構造揺らぎを測定するために、まず、蛍光色素テトラメチルローダミンと、それとエネルギー移動を起こすcy5で、二重標識した、βラクトグロブリンを作製した。これと分子シャペロンGroELとの複合体を、ゲルろ過によって単離した。GroELに結合したβラクトグロブリンを、エバネッセント場を利用した、全反射蛍光顕微鏡によって観察した。その結果、βラクトグロブリンに標識した蛍光試薬の蛍光スペクトルが、時間変化することを明らかにした。このことから、GroELに結合した基質蛋白質は、揺らいでいると推定した。
2.Βラクトグロブリンは、遊離のチオール基を、ひとつもっている。このチオール基は蛋白質内部に埋もれているが、DTNBなどのチオール滴定試薬によって修飾することができる。チオール基を修飾したβラクトグロブリンが、GroELと結合することを、ゲルろ過実験によって明らかにした。GroELと結合する基質蛋白質の立体構造を解析することは、相互作用を理解するために重要である。DTNBで修飾されたβラクトグロブリンの立体構造を、CD、沈降平衡、NMRなどで調べた。この結果、チオール基が修飾されることによって、βラクトグロブリンは、単量体となり、モルテングロビュールに類似した、揺らぎの大きい状態になっていることを示した。
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