緑膿菌バイオフィルム感染症治療に対する細菌アルギン酸リアーゼの機能と安全性

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10556017
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 村田 幸作 京都大学, 食糧科学研究所, 教授 (90142299)
• 研究分担者: 橋本 渉 京都大学, 食糧科学研究所, 助手 (30273519)
• キーワード: アルギン酸 / アルギン酸リアーゼ / Shingomonas属細菌 / バイオフィルム細菌感染症 / 緑膿菌 / X線結晶構造解析 / 嚢胞性線維症 / 抗原性

研究概要

緑膿菌感染症患者では、感染緑膿菌が生産する多糖アルギン酸がバイオフィルムとして作用し、抗生物質などの除菌効果を低減させるため難治性となる。現在、バイオフィルム性細菌感染症の有効な治療法はなく、新規な方法論の開発が待たれている。土壌分離細菌 Sphingomanas sp.A1株が生産する酵素アルギン酸リアーゼ(A1-III)は、病原性緑膿菌が生産するバイオフィルム(アルギン酸)を効率良く分解するため、バイオフィルム性細菌感染症の治療に有効である。しかし、微生物酵素を人体に適用するためには、その安全性、特に抗原性を完全に除去することが必須である。一般的に、抗原性の低減に関してはポリエチレングリコール(PEG)を用いた酵素の化学修飾が採用されている。そこで、アルギン酸リアーゼに関してもPEG修飾を施した結果、完全無抗原性に近い良好な酵素標品が得られた。しかし、このPEG修飾酵素をウサギ血中に環流させると、一部PEGが分解を受ける結果、PEGでマスクされていた抗原性が露出し、抗体を生成することが分かった。従って、完全無抵抗性酵素を作製するためには、酵素の抗原性エピトープの完全除去、或いは、非抗原エピトープへの構造的変換が必要と考えられた。生化学的手法で酵素の抗原性エピトープ部位を同定するため、酵素のN-及びC-末端から相当数のアミノ酸を除去した変異酵素を多数作製し、その大腸菌での大量生産を行った。現在、ラットを用いて抗原性部位の特定を進めている。また、抗原性除去には、酵素の高次構造に関する情報が不可欠である。そこで、A1-IIIのX線結晶構造を解析し、本酵素の立体構造と触媒部位の詳細な構造を明らかにした。現在、よりコンパクトな酵素に改造するためコンピューターグラフィックスによる構造・機能相関の解析を進めている。

研究成果

• [文献書誌] Wataru Hashimoto: "Characterization of α-L-rhamnosidase of Bacillus sp.GL1 responsible for the complete depolymerization of gella"Archives of Biochemistry and Biophysics. 368巻,1号. 56-60 (1999)
• [文献書誌] Wataru Hashimoto: "Unsaturated glucuronyl hydrolase of Bacillus sp.GL1: Novel enzyme prerequisite for metabolism of unsaturated oligosaccharides produced by polysaccharide lyases"Archives of Biochemistry and Biophysics. 368巻,2号. 367-374 (1999)
• [文献書誌] Hye-Jin Yoon: "Overexpression in Escherichia coli and characterization of Sphingomonas sp.A1 alginate lyase"Protein Expression and Purification. (印刷中). (2000)
• [文献書誌] Hye-Jin Yoon: "Crystal structure of alginate lyase A1-III from Sphingomonas sp.strain A1 at 1.78A resolution"Journal of Molecular Biology. 290巻. 505-514 (1999)
• [文献書誌] Wataru Hashimoto: "Enzymatic and Genetic Bases on Assimilation, Depolymerization, and Transport of Heteropolysaccharides in Bacteria"Journal of Bioscience and Bioengineering. 87巻,2号. 123-136 (1999)
• [文献書誌] Keiko Momma: "Special cell surface structure,and novel macromolecule transport/depolymerization system of Sphingomonas sp A1"Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 23巻,4/5号. 425-435 (1999)