サイトカイン遺伝子を導入したヘルペスウイルスベクターワクチンの開発

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10556061
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 大塚 治城 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 教授 (80261957)
• 研究分担者: 岩田 晃 (財)日本生物化学研究所, 研究部, 研究員 ; 玄 学南 帯広畜産大学, 原虫病分子免疫センター, 助手 (10292096) ; 小沼 操 北海道大学, 獣医学部, 教授 (70109510) ; 松本 安喜 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助教授 (90251420) ; 松本 芳嗣 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助教授 (00173922)
• キーワード: IL-12 / p35 / p40 / サイトカイン / ワクシニアウイルス / イヌヘルペスウイルス / INF-γ / LPS

研究概要

(目的)インターロイキン12(IL-12)は、p35とp40のサブユニットから成るサイトカインであり、NK細胞やT細胞の細胞傷害性の活性化や、INF-γ分泌を誘導し、またCD4^+T細胞のTh1型への分化を促進することにより、細胞性免疫において中心的な役割を果たす。本研究では、イヌのIL-12遺伝子をワクシニアウイルス及びイヌヘルペスウイルスに組み込み、発現させることにより、細胞性免疫を強く誘導する機能を持つ組換えウイルスの作出を目的としている。これまでに我々は、イヌのIL-12cDNAをRT-PCR法によりクローニングし、塩基配列を確認すると共に大腸菌により発現させた。
(方法・結果)イヌの末梢血単核細胞を単離し、LPSで刺激後、total RNAを抽出した。これを鋳型とし、既知の塩基配列をもとにp35とp40サブユニットそれぞれのそれぞれ蛋白質コード領域のみを増幅するようなプライマーを用いてRT-PCRを行い、約670bpと約990bpのフラグメントが得られた。それぞれのフラグメントをコードするcDNAクローンをTAクローニング法によりpCR2.1プラスミドにクローニングし、塩基配列を決定した。各クローンは既知のイヌの塩基配列との比較により、それぞれp35とp40のサブユニットであると同定した。
次に、抗IL-12抗体を得るためにGST fusion systemを用い、大腸菌によりIL-12のサブユニットp35とp40のcDNAそれぞれをGlutathione S-transferase(GST)との融合蛋白として大量発現する系の構築を試みた。GST遺伝子を含む発現プラスミドpGEX-5X-3にp35とp40のcDNAそれぞれ組み込んだpGEX/p35、pGEX/p40を作製した。これらのプラスミドを大腸菌DH5αに導入し、IPTGによる発現誘導後、p35とp40の産生をSDS-pageにより確認した。現在、この融合蛋白をマウスに免疫し、抗体IL-12抗体の作成中である。
また得られたIL-12cDNAを組み込んだ組換えワクシニアウイルス及びイヌヘルペスウイルスも、現在作成中である。

研究成果

• [文献書誌] Nishikawa,Y.,Xuan,X.and Otsuka,H.: "Identification and charaterization of the glycoprotein E and I genes of canine herpesvirus" Virus Research. 56. 77-92 (1998)
• [文献書誌] Takashima,Y.,Xuan,X.,Matsumoto.Y.,Onuma,M.,and Otsuka.H.: "Vaccinia virus recombinant expressing the p32 gene of Theileria segenti : immunization of mouse with the recombinants" IX International Congress if Parasitology,Ed.Tada,I.,Kojima,S.,and Tsuji,M. 9. 1229-1233 (1998)
• [文献書誌] Takashima,Y.,Tamura,Y.,Xuan,X.and Otsuka,H.: "Identification of the US3 gene product of BHV-I as a potein kinase and characterization of BHV-I mutants of the US3 gene" Virus Research. 59. 34 (1998)