| 研究課題/領域番号 |
10556071
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
稲葉 睦 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助教授 (00183179)
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| 研究分担者 |
松木 直章 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助手 (40251417)
高桑 雄一 東京女子医科大学, 医学部, 教授 (40113740)
高橋 迪雄 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 教授 (30011943)
山本 雅之 筑波大学, 基礎医学系先端学際領域研究センター, 教授 (50166823)
小野 憲一郎 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 教授 (50111480)
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| キーワード | 赤血球 / 転写因子 / プロモーター / GATA-1 / バンド3 / 遺伝性疾患 / 遺伝子治療 / 家畜 |
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| 研究概要 |
本研究では、牛のGATA-1遺伝子領域を単離し、マウスで得られた結果をもとに、プロモーター領域の構造を特定する。次いで、それが実際に赤血球系細胞で選択的に遺伝子発現を増強することを、まずレポーター遺伝子としてのLacZ(β-galactosidase)、あるいはLuc(Luciferase)の発現で、次いで実際にバンド3遺伝子の発現で実証する。採択が10月であったため、現在、下記のごとく初期段階にとどまっている。
A. 牛赤血球系細胞特異的GATA-1プロモーター領域の同定
1. 牛GATA-1遺伝子の単離:牛ゲノムDNAライブラリーを作製した。現在、マウスGATA-1をプローブとして5'上流領域を含む牛GATA-1遺伝子領域の単離をすすめている。試験的なPCRによる増幅で目的配列とほぼ同じサイズの断片が得られている。これが得られたら、その構造を解析し、以下をすすめる。
2. プラスミドの構築と発現検索:細胞での一過性発現のためにpRLベクター(Luc)、あるいはpSV-βベクター(LacZ)のレポーター遺伝子上流に牛GATA-1のプロモーター領域と推定される配列を組み込んだプラスミドベクターを構築し、ジーンガンで牛骨髄細胞に導入して赤血球系細胞におけるレポーターの特異的発現を形態観察と各酵素活性定量で実証する。
B. バンド3導入プラスミドの構築と細胞における発現
1. 上記プラスミドのレポーター遺伝子をバンド3cDNAに置換したバンド3遺伝子導入プラスミドpPGATAB3を調製し、同様に牛骨髄細胞に導入して赤血球系細胞におけるバンド3の発現を既存の抗牛バンド3抗体を用いて検討する。
2. 発現したバンド3が正常機能を有するか否かをDIDS高感受性の^<35>SO4^<2->、あるいは^<36>Cl^-取り込みによるアニオン輸送能の測定で検証する。
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