| 研究課題/領域番号 |
10556079
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 展開研究 |
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| 研究分野 |
応用分子細胞生物学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
熊谷 英彦 京都大学, 生命科学研究科, 教授 (70027192)
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| 研究分担者 |
石原 秀晴 岐阜大学, 工学部, 教授 (60021599)
纐纈 守 岐阜大学, 工学部, 助手 (50178208)
山本 憲二 京都大学, 生命科学研究科, 教授 (70109049)
澤武 紀雄 金沢大学, がん研究所, 教授 (90019969)
福味 廣員 福井工業大学, 工学部, 教授 (90288340)
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| 研究期間 (年度) |
1998 – 1999
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| キーワード | 肝ガン / 単クローン抗体 / 変異糖鎖 / α-フェトプロテイン / アルキドグルコシド / デンドグリコシダーゼ / 糖転移活性 |
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| 研究概要 |
肝細胞ガン患者の血清中には胎生期に現われる糖タンパク質であるα-フェトプロテインが出現し、腫瘍マーカーとして知られている。この糖タンパク質は一分子に一本のN-結合型糖鎖を有しているがガン性変異によって特有な構造になる。本研究では、ガン性変異を反映するα-フェトプロテインの糖鎖に注目し、この変異糖鎖に特異的な単クローン抗体を作製して、肝ガンの検査試薬を開発することを目的としている。鶏卵黄より見出された糖ペプチドの複合型二本鎖糖鎖はα-フェトプロテインの変異糖鎖に構造が類似しているので、本糖ペプチドを微生物のエンドグリコシダーゼを用いて免疫賦活物質に転移させた後、これを抗原として変異糖鎖に対する単クローン抗体の作製を試みた。
1.鶏卵の卵黄よりフェノール抽出とイオン交換カラムクロマトグラフィーによってN-結合型糖鎖(シアロ複合型二本鎖糖鎖)を有する糖ペプチドを大量調製した。
2.調製した糖ペプチドを糖鎖供与体とし、糸状菌のエンドグリコシダーゼの特異的な糖転移活性を利用して、免疫賦活作用を持ちかつ抗原性に乏しい糖アルキル(オクチルグルコシド)に糖鎖を転移付加して、多量のアルキル糖鎖を生成物として得た。
3.得られたアルキル糖鎖を抗原としてマウスの腹腔内に注射し免疫した。脾臓細胞を摘出してミエローマと細胞融合し、抗体を産生するハイブリドーマをシアロ複合型二本鎖糖鎖を含むヒト血清トランスフェリン糖ペプチドと鶏卵黄由来の糖ペプチドを用いてアッセイすることにより検索した。抗体産生が陽性のハイブリドーマについて限界希釈法により、産生細胞のクローニングを行った。その結果、抗体産生能の高い3株を得た。その内の一株をマウス腹腔内に注射して腹水液を作製した。腹水中にトランスフェリン糖ペプチドのシアロ複合型二本鎖糖鎖と反応する単クローン抗体が存在することを確認した。
4.同様にして、アシアロ複合型二本鎖糖鎖に対する単クローン抗体の作製を試みた。その結果、いくつかの抗体産生株を得て、抗体のクラスがIgMである可能性が示唆されたハイブリドーマを高産生株として選んだ。
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